Comunica experienta
MonitorulJuridic.ro

Trimite prin Yahoo Messenger pagina: ORDIN nr. 24 din 1 februarie 2007 privind aprobarea Normei sanitare veterinare ce stabileste metode de analiza pentru determinarea produselor amprolium, diclazuril si carbadox din furaje

Cautare document

Termen: Tipul actului: Anul publicarii actului:

Cautare document

Termen: Tipul actului: Anul publicarii actului:

Copierea de continut din prezentul site este supusa regulilor precizate in Termeni si conditii! Click aici.
Prin utilizarea siteului sunteti de acord, in mod implicit cu Termenii si conditiile! Orice abatere de la acestea constituie incalcarea dreptului nostru de autor si va angajeaza raspunderea!

ORDIN nr. 24 din 1 februarie 2007 privind aprobarea Normei sanitare veterinare ce stabileste metode de analiza pentru determinarea produselor amprolium, diclazuril si carbadox din furaje

EMITENT: AUTORITATEA NATIONALA SANITARA VETERINARA SI PENTRU SIGURANTA ALIMENTELOR
PUBLICAT: MONITORUL OFICIAL nr. 138 din 26 februarie 2007

Comenteaza legea

ORDIN nr. 24 din 1 februarie 2007
privind aprobarea Normei sanitare veterinare ce stabileşte metode de analiza pentru determinarea produselor amprolium, diclazuril şi carbadox din furaje
EMITENT: AUTORITATEA NATIONALA SANITARÃ VETERINARA ŞI PENTRU SIGURANTA ALIMENTELOR
PUBLICAT ÎN: MONITORUL OFICIAL nr. 138 din 26 februarie 2007

Având în vedere prevederile <>art. 10 lit. b) din Ordonanta Guvernului nr. 42/2004 privind organizarea activitãţii sanitar-veterinare şi pentru siguranta alimentelor, aprobatã cu modificãri şi completãri prin <>Legea nr. 215/2004 , cu modificãrile şi completãrile ulterioare,
în temeiul art. 3 alin. (3) şi al <>art. 4 alin. (3) din Hotãrârea Guvernului nr. 130/2006 privind organizarea şi funcţionarea Autoritãţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranta Alimentelor şi a unitãţilor din subordinea acesteia,
vazand Referatul de aprobare nr. 70.064 din 23 ianuarie 2007, întocmit de Direcţia de control şi coordonare a activitãţii farmaceutice veterinare din cadrul Autoritãţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranta Alimentelor,

preşedintele Autoritãţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranta Alimentelor emite urmãtorul ordin:

ART. 1
Se aproba Norma sanitarã veterinara ce stabileşte metode de analiza pentru determinarea produselor amprolium, diclazuril şi carbadox din furaje, prevãzutã în anexa care face parte integrantã din prezentul ordin.
ART. 2
Autoritatea Nationala Sanitarã Veterinara şi pentru Siguranta Alimentelor, institutele veterinare centrale şi direcţiile sanitar-veterinare şi pentru siguranta alimentelor judeţene şi a municipiului Bucureşti vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.
ART. 3
La data intrãrii în vigoare a prezentului ordin se abroga Ordinul preşedintelui Agenţiei Veterinare şi pentru Siguranta Alimentelor nr. 25/2004 pentru aprobarea Normei veterinare ce stabileşte metode naţionale de analiza pentru determinarea produselor amprolium, diclazuril şi carbadox din furaje, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 şi 1.020 bis din 4 noiembrie 2004.
ART. 4
Prezentul ordin transpune Directiva Comisiei 1999/27/CE din 20 aprilie 1999 ce stabileşte metode comunitare de analiza pentru determinarea produselor aprolium, diclazuril şi carbadox din furaje, amendeaza directivele 71/250/CEE şi 73/46/CE E şi abroga Directiva 74/203/CEE, publicatã în Jurnalul Oficial al Comunitãţilor Europene (JOCE) nr. L 118 din 6 mai 1999, p. 36.
ART. 5
Prezentul ordin va fi publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Preşedintele Autoritãţii Naţionale Sanitare Veterinare
şi pentru Siguranta Alimentelor,
Marian Avram

Bucureşti, 1 februarie 2007.
Nr. 24.

ANEXA

NORMA SANITARÃ VETERINARA
ce stabileşte metode de analiza pentru determinarea
produselor amprolium, diclazuril şi carbadox din furaje

ART. 1
Analizele pentru determinarea conţinutului în amprolium, diclazuril şi carbadox, efectuate în vederea controalelor oficiale ale furajelor şi ale premixurilor, trebuie sa fie efectuate utilizând metodele stabilite în anexa care face parte integrantã din prezenta norma sanitarã veterinara.
ART. 2
Autoritatea Nationala Sanitarã Veterinara şi pentru Siguranta Alimentelor informeazã Comisia Europeanã cu privire la actele normative şi prevederile administrative necesare pentru implementarea prezentei norme sanitare veterinare.

ANEXA
la norma sanitarã veterinara

PARTEA A
Determinarea produsului amprolium

[Clorhidrat de clorura de 1-[(4-amino-2-propil-5-pirimidin)metil]-2-metil-piridinium]

1. Scop şi domeniu de aplicare
Aceasta metoda se utilizeazã pentru determinarea produsului amprolium din furaje şi premixuri. Limita de detectie este de 1 mg/kg, iar limita de determinare este de 25 mg/kg.
2. Principiu
Proba este extrasa cu un amestec de metanol şi apa. Dupã diluare cu faza mobila şi filtrare prin membrana, conţinutul în amprolium se determina prin cromatografie lichidã de inalta performanta (HPLC) cu schimbatori de cationi, utilizând un detector UV.
3. Reactivi
3.1. Metanol
3.2. Acetonitril, de grad HPLC
3.3. Apa, de grad HPLC
3.4. Soluţie de fosfat dihidrogenat de sodiu, c = 0,1 mol/l
Se dizolva în apa 13,80 g de fosfat dihidrogenat de sodiu monohidrat (3.3) într-un balon gradat de 1.000 ml, se aduce la semn cu apa (3.3) şi se omogenizeaza.
3.5. Soluţie de perclorat de sodiu, c = 1,6 mol/l
Se dizolva 224,74 g de perclorat de sodiu monohidrat în apa (3.3) într-un balon gradat de 1.000 ml, se aduce la semn cu apa (3.3) şi se omogenizeaza.
3.6. Faza mobila pentru HPLC (vezi pct. 9.1)
Amestec de acetonitril (3.2), soluţie de fosfat dihidrogenat de sodiu (3.4) şi soluţie de perclorat de sodiu (3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v). Înainte de utilizare se filtreaza printr-un filtru cu membrana de 0,22 f2æm (4.3) şi se degazeaza soluţia [de exemplu, în baia cu ultrasunete (4.4) timp de cel puţin 15 minute].
3.7. Substanta etalon: amprolium pur, clorhidrat clorura de 1-[(4-amino-2-propil-5-pirimidin)metil]-2-metil-piridinium, E 750 (vezi 9.2)
3.7.1. Soluţie etalon stoc de amprolium, 500 f2æg/ml
Se cantaresc cu o precizie de 0,1 mg 50 mg de amprolium (3.7) într-un balon gradat de 100 ml, se dizolva în 80 ml de metanol (3.1) şi se plaseaza balonul timp de 10 minute într-o baie cu ultrasunete (4.4). Dupã tratamentul cu ultrasunete, se aduce soluţia la temperatura camerei, se aduce la semn cu apa şi se omogenizeaza. La o temperatura ≤ 4°C, soluţia este stabilã timp de o luna.
3.7.2. Soluţie etalon intermediara de amprolium, 50 f2æg/ml
Se pipeteaza 5 ml din soluţia etalon stoc (3.7.1) într-un balon gradat de 50 ml, se aduce la semn cu solvent de extracţie (3.8) şi se omogenizeaza. La o temperatura ≤ 4°C, soluţia este stabilã timp de o luna.
3.7.3. Soluţii de etalonare
Se transfera 0,5, 1 şi 2 ml din soluţia etalon intermediara (3.7.2) într-o serie de baloane gradate de 50 ml. Se aduce la semn cu faza mobila (3.6) şi se omogenizeaza. Aceste soluţii corespund la 0,5, 1 şi, respectiv, 2 f2æg de amprolium pe ml. Aceste soluţii trebuie sa fie proaspãt preparate înainte de utilizare.
3.8. Solvent de extracţie
Amestec de metanol (3.1) şi apa 2+1 (v+v)
4. Aparatura
4.1. Echipament HPLC cu sistem de injecţie, corespunzãtor injectarii de volume de 100 f2æl
4.1.1. Coloana pentru cromatografie lichidã de 125 mm x 4 mm cu schimbatori de cationi, umplere de Nucleosil 10 SA de 10 f2æm sau echivalenta
4.1.2. Detector UV cu lungime de unda variabila sau detector cu grup de diode
4.2. Filtru cu membrana, material PTFE, de 0,45 æm
4.3. Filtru cu membrana de 0,22 æm
4.4. Baie cu ultrasunete
4.5. Agitator mecanic sau magnetic
5. Procedura
5.1. Generalitati
5.1.1. Furaj martor
Pentru efectuarea testului de recuperare (5.1.2) trebuie analizat un furaj martor pentru a se verifica absenta amproliumului sau a substanţelor interferente. Furajul martor trebuie sa fie de tip similar cu cel al probei şi nu trebuie sa fie detectate amprolium sau substanţe interferente.
5.1.2. Teste de recuperare
Trebuie efectuat un test de recuperare prin analizarea furajului martor ce a fost imbogatit prin adãugarea unei cantitãţi de amprolium similare celei prezente în proba.
Pentru a obţine o concentraţie de 100 mg/kg se transfera 10 ml din soluţia etalon stoc (3.7.1) într-un balon conic de 250 ml şi se evapora soluţia pana la aproximativ 0,5 ml.
Se adauga 50 g de furaj martor, se amesteca cu grija şi se lasa timp de 10 minute, amestecand din nou de mai multe ori înainte de a continua cu faza de extracţie (5.2).
Alternativ, dacã nu este disponibil un furaj martor de tip similar celui din proba (a se vedea 5.1.1), poate fi efectuat un test de recuperare prin intermediul metodei de aditie a etalonului. În acest caz, în proba de analizat trebuie adãugatã o cantitate de amprolium similarã celei deja prezente în proba. Aceasta proba trebuie analizata împreunã cu proba neimbogatita, iar recuperarea poate fi calculatã prin diferenţa.
5.2. Extracţie
5.2.1. Premixuri (conţinut de amprolium < 1%) şi furaje
Se cantaresc cu o precizie de 0,01 g între 5 şi 40 g de proba, în funcţie de conţinutul în amprolium, într-un balon conic de 500 ml şi se adauga 200 ml de solvent de extracţie (3.8). Se plaseaza balonul în baia cu ultrasunete (4.4) şi se lasa timp de 15 minute. Se scoate balonul din baia cu ultrasunete şi se agita timp de o ora cu agitatorul mecanic sau cu agitatorul magnetic (4.5). Se dilueaza o parte alicota a extractului cu faza mobila (3.6) pentru obţinerea unui conţinut în amprolium de 0,5-2 f2æg/ml şi se amesteca (vezi observatia 9.3). Se filtreaza 5-10 ml din aceasta soluţie diluata printr-un filtru cu membrana (4.2). Se continua cu determinarea HPLC (5.3).
5.2.2. Premixuri (conţinut 1% amprolium)
Se cantaresc cu o precizie de 0,001 g 1-4 g de premix, în funcţie de conţinutul în amprolium, într-un balon conic de 500 ml şi se adauga 200 ml de solvent de extracţie (3.8). Se plaseaza balonul în baia cu ultrasunete (4.4) şi se lasa timp de 15 minute. Se scoate balonul din baia cu ultrasunete şi se agita timp de o ora cu agitatorul mecanic sau cu agitatorul magnetic (4.5). Se dilueaza o parte alicota a extractului cu faza mobila (3.6) pentru obţinerea unui conţinut în amprolium de 0,5-2 f2æg/ml şi se amesteca. Se filtreaza 5-10 ml din aceasta soluţie diluata printr-un filtru cu membrana (4.2). Se continua cu determinarea HPLC (5.3).
5.3. Determinarea HPLC
5.3.1. Parametri:
Sunt oferite pentru orientare urmãtoarele condiţii; pot fi utilizate alte condiţii numai dacã acestea dau rezultate echivalente:


     Coloana cromatografica        125 mm x 4 mm, cu
     lichidã (4.1.1):              schimbatori de cationi,
                                   umplere de Nucleosil 10 SA
                                   de 10 f2æm sau echivalenta
     Faza mobila (3.6):            Amestec de acetonitril (3.2),
                                   soluţie de fosfat dihidrogenat
                                   de sodiu (3.4) şi soluţie de
                                   perclorat de sodiu (3.5), 450
                                   + 450 + 100 (v+v+v)
     Debit:                        0,7-1 ml/min
     Lungimea undei de detectie:   264 nm
     Volum de injecţie:            100 f2æl

Stabilitatea sistemului cromatografic se verifica prin injectarea de mai multe ori a soluţiei de etalonare (3.7.3) conţinând 1,0 f2æg/ml, pana la obţinerea de înãlţimi ale picului şi timpi de retenţie constanti.
5.3.2. Curba de etalonare
Fiecare soluţie de etalonare (3.7.3) se injecteaza de mai multe ori şi se determina inaltimile (ariile) medii ale picului pentru fiecare concentraţie. Se stabileşte o curba de etalonare utilizând inaltimile (ariile) medii ale picului ale soluţiilor de etalonare ca ordonate şi concentratiile corespondente, în f2æg/ml, ca abcise.
5.3.3. Soluţia probei
Se injecteaza extractul din proba (5.2) de mai multe ori, utilizând acelaşi volum ca cel utilizat pentru soluţiile de etalonare, şi se determina înãlţimea (aria) medie a picului pentru amprolium.
6. Calculul rezultatelor
Concentratia soluţiei probei în f2æg/ml, prin referire la curba de etalonare (5.3.2), se determina plecand de la înãlţimea (aria) medie a picurilor pentru amprolium a soluţiei din proba.
Conţinutul probei în amprolium w, exprimat în mg/kg, se determina prin utilizarea urmãtoarei formule:


          V x f2â x f w

în care:
V = volumul solventului de extracţie (3.8) în ml, conform 5.2 (adicã 200 ml);
f2â = concentratia de amprolium din extractul din proba (5.2), în f2æg/ml;
f = factorul de dilutie conform 5.2;
m = masa porţiunii de test, în g.
7. Validarea rezultatelor
7.1. Identitate
Identitatea substanţei de analizat poate fi confirmatã prin cocromatografie sau utilizând un detector cu grup de diode, prin intermediul cãruia sunt comparate spectrele extractului probei (5.2) şi ale soluţiei de etalonare (3.7.3) conţinând 2,0 f2æg/ml.
7.1.1. Cocromatografie
Un extract din proba (5.2) este imbogatit prin adãugarea unei cantitãţi corespunzãtoare din soluţia de etalonare (3.7.3). Cantitatea de amprolium adãugatã trebuie sa fie similarã cantitãţii de amprolium constatate în extractul probei.
Numai înãlţimea picului de amprolium ar trebui sa creascã dupã luarea în considerare atât a cantitãţii adãugate, cat şi a dilutiei extractului. Largimea picului, la jumãtatea inaltimii sale, trebuie sa se situeze la ± 10% din largimea iniţialã a picului de amprolium al extractului probei neimbogatite.
7.1.2. Detectie cu grupuri de diode
Rezultatele sunt evaluate în conformitate cu urmãtoarele criterii:
a) lungimea de unda a absorbtiei maxime a spectrelor probei şi a etalonului, înregistratã la varful picului pe cromatograma, trebuie sa fie aceeaşi într-o marja determinata de puterea de rezoluţie a sistemului de detectie. Pentru detectia cu grupuri de diode, aceasta este în general de ± 2 nm;
b) între 210 şi 320 nm, spectrele probei şi ale etalonului, înregistrate la varful picului cromatogramei, trebuie sa fie identice pentru acele pãrţi ale spectrului situate între 10 şi 100% din absorbanta relativã. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt prezente aceleaşi maxime, iar deviatia dintre cele doua spectre nu depãşeşte 15% în niciun punct observat din absorbanta substanţei etalon de analizat;
c) între 210 şi 320 nm, spectrele curbei ascendente, ale varfului şi ale curbei descendente a picului produse de extractul din proba trebuie sa fie identice pentru acele pãrţi ale spectrului situate între 10 şi 100% din absorbanta relativã. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt prezente aceleaşi maxime şi când la toate punctele observate deviatia dintre spectre este de maximum 15% din absorbanta spectrului varfului picului. Prezenta substanţei de analizat este confirmatã doar dacã criteriile de la lit. a), b) şi c) sunt îndeplinite.
7.2. Repetabilitate
Diferenţa dintre rezultatele a doua determinãri paralele efectuate pe aceeaşi proba trebuie sa fie de maximum:
a) 15% din valoarea superioarã, pentru un conţinut în amprolium între 25 mg/kg şi 500 mg/kg;
b) 75 mg/kg pentru un conţinut în amprolium între 500 mg/kg şi 1.000 mg/kg;
c) 7,5% din valoarea superioarã, pentru un conţinut în amprolium mai mare de 1.000 mg/kg.
7.3. Recuperare
Pentru o proba (martor) imbogatita, recuperarea trebuie sa fie de cel puţin 90%.
8. Rezultatele unui studiu de colaborare (interlaboratoare)
A fost organizat un studiu de colaborare, în cursul cãruia au fost analizate 3 furaje pentru pãsãri (probele 1-3), un furaj mineral (proba 4) şi un premix (proba 5). Rezultatele sunt prezentate în urmãtorul tabel:


 ┌─────────────────────────┬──────────┬─────────┬─────────┬─────────┬─────────┐
 │                         │  Proba 1 │         │         │         │         │
 │                         │ (furaj   │ Proba 2 │ Proba 3 │ Proba 4 │ Proba 5 │
 │                         │ martor)  │         │         │         │         │
 ├─────────────────────────┼──────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │L                        │    14    │    14   │   14    │    14   │    15   │
 ├─────────────────────────┼──────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │n                        │    56    │    56   │   56    │    56   │    60   │
 ├─────────────────────────┼──────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │medie (mg/kg)            │     -    │   45,5  │   188   │  5.129  │  25.140 │
 ├─────────────────────────┼──────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │s(r)(mg/kg)              │     -    │   2,26  │  3,57   │   178   │    550  │
 ├─────────────────────────┼──────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │CV(r)(%)                 │     -    │   4,95  │  1,90   │   3,46  │   2,20  │
 ├─────────────────────────┼──────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │s(R)(mg/kg) CV(R)(%)     │     -    │   2,95  │  11,8   │   266   │    760  │
 ├─────────────────────────┼──────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │CV(R)[%]                 │     -    │   6,47  │  6,27   │   5,19  │   3,00  │
 ├─────────────────────────┼──────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │Conţinut nominal (mg/kg) │     -    │    50   │   200   │  5.000  │  25.000 │
 ├─────────────────────────┴──────────┴─────────┴─────────┴─────────┴─────────┤
 │L:     numãr de laboratoare                                                 │
 │n:     numãr de valori unice                                                │
 │s(r):  deviatie standard a repetabilitatii                                  │
 │CV(r): coeficient de variatie a repetabilitatii                             │
 │S(R):  deviatie standard a reproductibilitatii                              │
 │CV(R): coeficient de variatie a reproductibilitatii                         │
 └────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘

9. Observaţii
9.1. Dacã proba conţine tiamina, picul tiaminei din cromatograma apare puţin înainte de picul amproliumului. Potrivit acestei metode, amproliumul şi tiamina trebuie sa fie separate. Dacã amproliumul şi tiamina nu sunt separate de coloana (4.1.1) utilizata în aceasta metoda, se înlocuieşte cu metanol pana la 50% din partea de acetonitril a fazei mobile (3.6).
9.2. Conform Farmacopeoi britanice, spectrul soluţiei de amprolium (c = 0,02 mol/l) în acid clorhidric (c = 0,1 mol/l) prezintã maxime la 246 nm şi 262 nm. Absorbanta va fi de 0,84 la 246 nm şi de 0,80 la 262 nm.
9.3. Extractul trebuie sa fie întotdeauna diluat în timpul fazei mobile, pentru a impiedica schimbarea semnificativã a timpului de retenţie al picului amproliumului datoritã schimbãrilor din forta ionica.

PARTEA B
Determinarea diclazurilului (+)-4-clorfenil [2,6
diclor-4-(2,3,4,5-tetrahidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2yl)
fenil]-acetonitril

1. Scop şi domeniu de aplicare
Metoda se utilizeazã pentru determinarea diclazurilului din furaje şi premixuri. Limita de detectie este de 0,1 mg/kg, iar limita de determinare este de 0,5 mg/kg.
2. Principiu
Dupã aditia unui etalon intern, proba trebuie extrasa cu metanol acidifiat. Pentru furaje, o parte alicota a extractului este purificata pe un cartus C18 pentru extracţie în faza solida. Diclazurilul este eluat din cartus cu un amestec de metanol acidifiat şi apa. Dupã evaporare, reziduul este dizolvat în DMF/apa. Pentru premixuri, extractul trebuie evaporat, iar reziduul trebuie dizolvat în DMF/apa. Conţinutul în diclazuril se determina prin cromatografie în faza lichidã de inalta performanta (HPLC) cu gradient ternar şi în faza inversa, prin utilizarea unui detector UV.
3. Reactivi
3.1. Apa, de grad HPLC
3.2. Acetat de amoniu
3.3. Hidrogenosulfat de tetrabutilamoniu (TBHS)
3.4. Acetonitrii, de grad HPLC
3.5. Metanol, de grad HPLC
3.6. N, N-dimetilformamida (DMF)
3.7. Acid clorhidric, p(20) = 1,19 g/ml
3.8. Substanta etalon: diclazuril ((11)-24: [2,6 dicloro-(4-clorofenil)-4-(2, 3, 4, 5-tetrahidro-3,5-dioxo-1, 2, 4-triazin-2-yl) fenil]-acetonitril, cu puritate garantatã, E771
3.8.1. Soluţie etalon stoc de diclazuril, 500 /f2æg/ml
Se cantaresc cu o precizie de 0,1 mg 25 mg de substanta etalon de diclazuril (3.8) într-un balon gradat de 50 ml. Se dizolva în DMF (3.6), se aduce la semn cu DMF (3.6) şi se omogenizeaza. Se impacheteaza balonul într-o foaie de aluminiu sau se utilizeazã un balon de culoare bruna şi se depoziteaza în frigider. La o temperatura 𕟬°C, soluţia este stabilã timp de o luna.
3.8.2. Soluţie etalon de diclazuril, 50 f2æg/ml
Se transfera 5,00 ml din soluţia etalon stoc (3.8.1) într-un balon gradat de 50 ml, se aduce la semn cu DMF (3.6) şi se omogenizeaza. Se impacheteaza balonul într-o folie de aluminiu sau se utilizeazã un balon de culoare bruna şi se depoziteaza în frigider. La o temperatura 𕟬°C, soluţia este stabilã timp de o luna.
3.9. Substanta etalon interna: 2,6 dicloro-a-[4-chlorofenil]-4-[4,5dihidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazina-2 (3H)-yl] a-metilbenzen-acetonitril
3.9.1. Soluţie etalon stoc interna, 500 f2æg/ml
Se cantaresc cu o precizie de 0,1 ml 25 mg de substanta etalon interna (3.9) într~un balon gradat de 50 ml. Se dizolva în DMF (3.6), se aduce la semn cu DMF (3.6) şi se omogenizeaza. Se impacheteaza balonul într-o folie de aluminiu sau se utilizeazã un balon de culoare bruna şi se depoziteaza în frigider. La o temperatura 𕟬°C, soluţia este stabilã timp de o luna.
3.9.2. Soluţie etalon interna, 50 f2æg/ml. Se transfera 5,00 ml din soluţia etalon stoc interna (3.9.1) într-un balon gradat de 50 ml, se aduce la semn cu DMF (3.6) şi se omogenizeaza. Se impacheteaza flaconul într-o folie de aluminiu sau se utilizeazã un balon de culoare bruna şi se depoziteaza în frigider. La o temperatura 𕟬°C, soluţia este stabilã timp de o luna.
3.9.3. Soluţie etalon interna pentru premixuri, p/1.000 mg/ml (p = conţinut nominal în diclazuril al premixului în mg/kg). Se cantaresc cu o precizie de 0,1 mg 10 mg de substanta etalon interna într-un balon gradat de 100 ml, se dizolva în DMF (3.6) într-o baie cu ultrasunete (4.6), se aduce la semn cu DMF şi se omogenizeaza. Se impacheteaza flaconul într-o folie de aluminiu sau se utilizeazã un flacon de culoare bruna şi se depoziteaza în frigider. La o temperatura 𕟬°C, soluţia este stabilã timp de o luna.
3.10. Soluţie de etalonare, 2 f2æg/ml
Se pipeteaza 2,00 ml de soluţie etalon de diclazuril (3.8.2) şi 2,00 ml de soluţie etalon interna (3.9.2) într-un balon gradat de 50 ml. Se adauga 16 ml de DMF (3.6), se aduce la semn cu apa şi se omogenizeaza. Aceasta soluţie trebuie sa fie proaspãt preparata înainte de utilizare.
3.11. Cartus C 18 pentru extracţie în faza solida, de exemplu, Bond Elut, mãrime: 1 cc, masa de sorbtie: 100 mg
3.12. Solvent de extracţie: metanol acidifiat
Se pipeteaza 5,0 ml de acid clorhidric (3.7) în 1.000 ml de metanol (3.5) şi se omogenizeaza.
3.13. Faza mobila pentru HPLC
Solvent A: acetat de amoniu - soluţie de hidrogenosulfat de tetrabutilamoniu.
3.13.1. Se dizolva 5 g de acetat de amoniu (3.2) şi 3,4 g de TBHS (3.3) în 1.000 ml de apa (3.1) şi se omogenizeaza.
3.13.2. Solvent B: acetonitril (3.4)
3.13.3. Solvent C: metanol (3.5)
4. Aparatura
4.1. Agitator mecanic
4.2. Echipament pentru HPLC cu gradient ternar
4.2.1. Coloana pentru cromatografie lichidã, umplere de Hypersil ODS de 3 f2æm, 100 mm x 4,6 mm sau echivalent.
4.2.2. Detector UV cu lungime de unda variabila sau detector cu grup de diode
4.3. Evaporator rotativ în vid
4.4. Filtru cu membrana de 0,45 f2æm
4.5. Distribuitor în vid
4.6. Baie cu ultrasunete
5. Procedura
5.1. Generalitati
5.1.1. Furaj martor
Absenta diclazurilului şi a substanţei interferente se verifica prin analiza unui furaj martor. Furajul martor trebuie sa fie de tip similar cu proba şi la analiza nu trebuie sa fie detectate diclazuril sau substanţe interferente.
5.1.2. Test de recuperare
Testul de recuperare se efectueazã prin analizarea furajului martor ce a fost imbogatit prin adãugarea unei cantitãţi de diclazuril similare celei prezente în proba. Pentru obţinerea unei concentratii de 1 mg/kg se adauga 0,1 ml din soluţia etalon stoc (3.8.1) la 50 g dintr-un furaj martor, se amesteca cu grija şi se lasa timp de 10 minute, amestecand din nou de mai multe ori înainte de procedeul de extracţie (5.2).
Alternativ, dacã un furaj martor de tip similar probei nu este disponibil (vezi 5.1.1), poate fi efectuat un test de recuperare prin intermediul metodei de aditie a etalonului. În acest caz, proba ce urmeazã sa fie analizata trebuie imbogatita cu o cantitate de diclazuril similarã celei deja prezente în proba. Aceasta proba se analizeazã alãturi de proba neimbogatita, iar recuperarea se calculeazã prin diferenţa.
5.2. Extracţie
5.2.1. Furaje
Se cantaresc cu o precizie de 0,01 g aproximativ 50 g din proba. Se transfera într-un balon conic de 500 ml, se adauga 1,00 ml din soluţia etalon interna (3.9.2), 200 ml solvent de extracţie (3.12) şi se astupa balonul. Se agita amestecul cu agitatorul (4.1) pe parcursul nopţii. Se lasa sa se depunã timp de 10 minute. Se transfera o parte alicota de 20 ml din supernatant într-un recipient de sticla corespunzãtor şi se dilueaza cu 20 ml de apa. Se transfera aceasta soluţie într-un cartus de extracţie (3.11) şi se trece prin vid (4.5). Se spala cartusul cu 25 ml dintr-un amestec de solvent de extracţie (3.12) şi apa, 65 + 35 (V + V). Se elimina fracţiunile colectate şi se elueaza compusii cu 25 ml dintr-un amestec de solvent de extracţie (3.12) şi apa, 80 + 20 (V + V). Se evapora aceasta fracţiune pana când aceasta ajunge la sec, prin intermediul evaporatorulul rotativ (4.3) la 60°C. Se dizolva reziduul în 1,0 ml de DMF (3.6), se adauga 1,5 ml de apa (3.1) şi se amesteca. Se filtreaza printr-un filtru cu membrana (4.4). Se continua cu determinarea HPLC (5.3).
5.2.2. Premixuri
Se cantareste cu o precizie de 0,001 g aproximativ 1 g din proba. Se transfera într-un balon conic de 500 ml, se adauga 1,00 ml din soluţia etalon interna (3.9.3), 200 ml de solvent de extracţie (3.2), şi se astupa balonul. Se agita amestecul pe parcursul nopţii cu agitatorul (4.1). Se lasa sa se depunã timp de 10 minute. Se transfera o parte alicota de 10000/p ml (p = conţinut nominal în diclazuril al premixului în mg/kg) din supenatant într-un balon cu fundul rotund de mãrime adecvatã. Se evapora pana când acesta ajunge la sec, sub presiune redusã la 60°C, prin intermediul evaporatorulul rotativ (4.3). Se redizolva reziduul în 10,0 ml de DMF (3.6), se adauga 15,0 ml de apa (3.1) şi se omogenizeaza. Se continua cu determinarea HPLC (5.3).
5.3. Determinarea HPLC
5.3.1. Parametri
Sunt oferite spre orientare urmãtoarele condiţii; pot fi utilizate alte condiţii numai dacã acestea dau rezultate echivalente.


     Coloana cromatografica lichidã (4.2.1)          100 mm x 4,6 mm, umplere de
                                                     Hypersil ODS de f2æm sau
                                                     echivalent
     Faza mobila:             Solvent A (3.13.1):        Soluţie apoasa de acetat
                                                         de amoniu şi
                                                         hidrogenosulfat de
                                                         tetrabutilamoniu
                              Solvent B (3.13.2):        acetonitril
                              Solvent C (3.13.3):        metanol
     Mod de elutie:           - gradient linear
                              - condiţii iniţiale: A+B+C = 60+20+20 (v+v+v)
                              - dupã 10 minute, elutia prin gradient timp de 30
                              de minute la A+B+C = 45+20+35 (v+v+v)
                              Se clateste cu B timp de 10 minute.
     Debit:                   1,5-2 ml/min
     Volum de injecţie:       20 f2æl
     Lungimea undei de
     detectie:                280 æl

Stabilitatea sistemului cromatografie se verifica prin injectarea de mai multe ori a soluţiei de etalonare (3.10), conţinând 2 f2æg/ml, pana când sunt obţinute înãlţimi ale picului şi timpi de retenţie constanti.
5.3.2. Soluţie de etalonare
Înãlţimea (zona) medie a picului de diclazuril şi picurile etalonului intern se determina prin injectarea a 20 f2æl din soluţia de etalonare (3.10) de mai multe ori.
5.3.3. Soluţia din proba
Înãlţimea (zona) medie a picului de diclazuril şi picurile etalonului intern se determina prin injectarea a 20 f2æl din soluţia din proba (5.2.1 sau 5.2.2) de mal multe ori.
6. Calculul rezultatelor
6.1. Furaje
Conţinutul probei în diclazuril w (mg/kg) se determina prin utilizarea urmãtoarei formule:


 
          h(d,s) x h(i,c)     f2δ(d,c) x 10V

h(i,s) X h(d,c) m

unde:
h(d,s) = înãlţimea (aria) picului de diclazuril în soluţia de proba (5.2.1);
h(i,s) = înãlţimea (aria) picului etalonului Intern în soluţia de proba (5.2.1);
h(d,c) = înãlţimea (aria) picului de diclazuril în soluţia de etalonare (3.10);
h(i,c) = înãlţimea (aria) picului etalonului intern în soluţia de etalonare (3.10);
f2δ(d,c) = concentratia diclazurilului în soluţia de etalonare în f2æg/ml (3.10);
m = masa porţiunii de test în g;
V = volumul extractului probei conform 5.2.1 (de exemplu 2,5 ml).

6.2. Premixuri
Conţinutul în diclazuril w (mg/kg) din proba se determina prin utilizarea urmãtoarei formule:


 
          h(d,s) x h(i,c)     f2δ(d,c) x 0,02 V.p

h(i,s) X h(d,c) m

unde:
h(d,c) = înãlţimea (aria) picului de diclazuril în soluţia de etalonare (3.10);
h(i,c) = înãlţimea (aria) picului etalonului intern în soluţia de etalonare (3.10);
h(d,s) = înãlţimea (aria) picului de diclazuril în soluţia probei (5.2.1);
h(i,s) = înãlţimea (aria) picului etalonului intern în soluţia probei (5.2.1);
f2δ(d,c) = concentratia diclazurilului în soluţia de etalonare (3.10);
m = masa porţiunii de test în g;
V = volumul extractului probei conform 5.2.1 (de exemplu 2,5 ml).
p = conţinutul nominal de diclazuril în mg/kg din premix.

7. Validarea rezultatelor
7.1. Identitate
Identitatea substanţei de analizat poate fi confirmatã prin cocromatografie sau prin utilizarea unui detector cu grup de diode prin care sunt comparate spectrele extractului din proba (5.2.1 sau 5.2.2) şi ale soluţiei de etalonare (3.10).
7.1.1. Cocromatografie
Un extract din proba (5.2.1 sau 5.2.2) este imbogatit prin adãugarea unei cantitãţi corespunzãtoare din soluţia de etalonare (3.10). Cantitatea de diclazuril adãugatã trebuie sa fie similarã cu cantitatea de diclazuril constatatã în extractul din proba.
Numai înãlţimea picului de diclazuril şi a picului etalonului intern ar trebui sa creascã dupã luarea în considerare atât a cantitãţii adãugate, cat şi a dilutiei extractului. Largimea picului, la jumãtatea inaltimii sale, trebuie sa se situeze la ± 10% din largimea iniţialã a picului de diclazuril sau a picului etalonului intern al extractului din proba neimbogatita.
7.1.2. Detectare cu grup de diode
Rezultatele sunt evaluate în conformitate cu urmãtoarele criterii:
a) lungimea de unda de absorbţie maxima a spectrelor probei şi a etalonului, înregistrate la varful picului pe cromatograma, trebuie sa fie aceeaşi, cu o marja stabilitã de puterea de rezoluţie a sistemului de detectie. Pentru detectia cu grup de diode, aceasta este în general de ± 2 nm;
b) între 230 şi 320 nm, spectrele probei şi ale etalonului, înregistrate la varful picului cromatogramei, trebuie sa fie identice pentru acele pãrţi ale spectrului situate între 10 şi 100% din absorbanta relativã. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt prezente aceleaşi maxime, iar deviatia dintre cele doua spectre nu depãşeşte 15% în niciun punct observat din absorbanta substanţei etalon de analizat;
c) între 230 şi 320 nm, spectrele curbei ascendente, ale varfului şi ale curbei descendente ale picului produse de extractul probei trebuie sa fie aceleaşi pentru acele pãrţi ale spectrului situate între 10 şi 100% din absorbanta relativã. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt prezente aceleaşi maxime şi când la toate punctele observate deviatia între spectre este de maximum 15% din absorbanta spectrului varful picului.
Prezenta substanţei de analizat este confirmatã doar dacã toate celelalte 3 criterii (a, b şi c) sunt îndeplinite.
7.2. Repetabilitate
Diferenţa dintre rezultatele a doua determinãri paralele efectuate pe aceeaşi proba trebuie sa fie de maximum:
a) 30% din valoarea superioarã, pentru un conţinut în diclazuril situat între 0,5 şi 2,5 mg/kg;
b) 0,75 mg/kg pentru un conţinut în diclazuril situat între 2,5 şi 5 mg/kg;
c) 15% din valoarea superioarã, pentru un conţinut în diclazuril mai mare de 5 mg/kg.
7.3. Recuperare
Pentru o proba (martor) imbogatita, recuperarea trebuie sa fie de cel puţin 80%.
8. Rezultatele unui studiu de colaborare
A fost organizat un studiu de colaborare în care au fost analizate 5 probe de cãtre 11 laboratoare. Aceste probe au constat în doua premixuri; unul a fost amestecat cu o matrice organicã (O 100) şi celãlalt cu o matrice anorganica (A 100). Conţinutul teoretic este de 100 mg de diclazuril pe kg. Cele 3 furaje amestecate pentru pãsãri au fost fabricate de 3 producãtori diferiţi (NL) (LI/ZI/KI). Conţinutul teoretic este de 1 mg de diclazuril pe kg. Laboratoarele au fost instruite sa analizeze fiecare dintre probe o singura data sau în dublu. (Informaţii mai detaliate cu privire la acest studiu de colaborare pot fi gãsite în Jurnalul AOAC internaţional, volumul 77, nr. 6, 1994, pag, 1359-1361.) Rezultatele sunt date în tabelul urmãtor:


 ┌─────────────────────────┬──────────┬─────────┬─────────┬─────────┬─────────┐
 │                         │ Proba 1  │ Proba 2 │ Proba 3 │ Proba 4 │ Proba 5 │
 │                         │  A 100   │  O 100  │  L 1    │  Z 1    │   K 1   │
 ├─────────────────────────┼──────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │L                        │    11    │    11   │   11    │    11   │     6   │
 ├─────────────────────────┼──────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │n                        │    19    │    18   │   19    │    19   │    12   │
 ├─────────────────────────┼──────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │Medie                    │  100,8   │  103,5  │  0,89   │   1,15  │   0,89  │
 ├─────────────────────────┼──────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │s(r)(mg/kg)              │   5,88   │   7,64  │  0,15   │   0,02  │   0,03  │
 ├─────────────────────────┼──────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │CV(r)(%)                 │   5,83   │   7,38  │  17,32  │   1,92  │   3,34  │
 ├─────────────────────────┼──────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │s(R)(mg/kg)              │   7,59   │   7,64  │  0,17   │   0,11  │   0,12  │
 ├─────────────────────────┼──────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │CV(R)[%]                 │   7,53   │   7,38  │  18,61  │   9,67  │  13,65  │
 ├─────────────────────────┼──────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │Conţinut nominal (mg/kg) │    100   │   100   │     1   │      1  │      1  │
 ├─────────────────────────┴──────────┴─────────┴─────────┴─────────┴─────────┤
 │L:     numãr de laboratoare                                                 │
 │n:     numãr de valori unice                                                │
 │s(r):  deviatie standard a repetabilitatii                                  │
 │CV(r): coeficient de variatie a repetabilitatii                             │
 │S(R):  deviatie standard a reproductibilitatii                              │
 │CV(R): coeficient de variatie a reproductibilitatii                         │
 └────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘

9. Observaţii
Rãspunsul diclazurilului trebuie sa fi fost demonstrat în prealabil ca fiind linear peste gama de concentratii ce sunt mãsurate.

PARTEA C
Determinarea carbadoxului
Metil 3-(2-quinoxalinilmetilena)carbazat N(1), N(4)-dioxid

1. Scop şi domeniu de aplicare
Prezenta metoda se utilizeazã pentru determinarea carbadoxului din furaje, premixuri şi preparate. Limita de detectie este de 1 mg/kg, Limita de determinare este de 10 mg/kg.
2. Principiu
Proba se echilibreaza cu apa şi se extrage cu metanol-acetonitril. Pentru furaje, o parte alicota a extractului filtrat trebuie supusã purificarii pe o coloana de oxid de aluminiu. Pentru premixuri şi preparate, o parte alicota a extractului filtrat trebuie diluata la o concentraţie corespunzãtoare cu apa, metanol şi acetonitril. Conţinutul în carbadox se determina prin cromatografie lichidã de inalta performanta (HPLC) în faza inversa, utilizând un detector cu UV.
3. Reactivi
3.1. Metanol
3.2. Acetonitril, de grad HPLC
3.3. Acid acetic, w = 100%
3.4. Oxid de aluminiu: neutru, grad de activitate I
3.5. Metanol-acetonitril 1 + 1 (v + v)
Se amesteca 500 ml de metanol (3.1) cu 500 ml de acetonitril (3.2)
3.6. Acid acetic, o = 10%
Se dilueaza 10 ml de acid acetic (3.3) cu apa pana la 100 ml
3.7. Acetat de sodiu, CH(3)COONa
3.8. Apa, de grad HPLC
3.9. Soluţie tampon de acetat, c = 0,01 mol/l, pH = 6,0
Se dizolva 0,82 g de acetat de sodiu (3.7) în 700 ml de apa (3.8) şi se ajusteaza pH-ul la 6,0 cu acid acetic (3.6). Se transfera într-un balon gradat de 1.000 ml, se aduce la semn cu apa (3.8) şi se omogenizeaza.
3.10. Faza mobila pentru HPLC
Se amesteca 825 ml de soluţie tampon de acetat (3.9) cu 175 ml de acetonitril (3.2). Se filtreaza printr-un filtru de 0,22 f2æm (4.5) şi se degazeaza soluţia (de exemplu, prin tratare cu ultrasunete timp de 10 minute).
3.11. Substanta etalon
Carbadox pur: metil 3-(2-quinoxalinilmetilena)carbazat N(1), N(4)-dioxid-E850
3.11.1. Soluţie etalon stoc de carbadox, 100 f2æg/ml (vezi pct. 5 Procedura):
Se cantaresc, cu o precizie de 0,1 mg, 25 mg de substanta etalon de carbodax (3.11) într-un balon gradat de 250 ml. Se dizolva în metanol-acetonitril (3.5) prin tratare cu ultrasunete (4.7). Dupã tratamentul cu ultrasunete se aduce soluţia la temperatura camerei, se aduce la semn cu metanol-acetonitril (3.5) şi se omogenizeaza. Se ambaleaza balonul într-o folie de aluminiu sau se utilizeazã sticlarie de culoare bruna şi se depoziteaza într-un frigider. La o temperatura ≤ 4°C, soluţia este stabilã timp de o luna.
3.11.2. Soluţii de etalonare
Se transfera 2,0, 5,0, 10,0 şi 20,0 ml din soluţia etalon stoc (3.11.1) într-o serie de baloane gradate de 100 ml. Se adauga 30 ml de apa, se aduce la semn cu metanol-acetonitril (3.5) şi se omogenizeza. Se ambaleaza baloanele în folii de aluminiu. Aceste soluţii corespund la 2,0, 5,0, 10,0 şi, respectiv, 20,0 f2æg/ml de carbadox. Soluţiile de etalonare trebuie sa fie proaspãt preparate înainte de utilizare.
NOTA:
Pentru determinarea carbadoxului din furaje ce conţin mai puţin de 10 mg/kg trebuie sa se prepare soluţii de etalonare cu o concentraţie inferioarã valorii de 2,0 f2æg/ml.
3.12. Amestec de apa-[metanol-acetonitril] (3.5), 300 + 700 (v + v)
Se amesteca 300 ml de apa cu 700 ml din amestecul de metanol-acetonitril (3.5).
4. Aparatura
4.1. Agitator de laborator sau magnetic
4.2. Hârtie de filtru din fibra de sticla (Whatman GF/A sau echivalent)
4.3. Coloana de sticla (lungime de 300 - 400 mm, diametru intern de aproximativ 10 mm), cu frita de sticla sinterizata şi valva de evacuare
NOTA:
Poate fi utilizata, de asemenea, o coloana de sticla prevãzutã cu un robinet sau o coloana de sticla cu o extremitate efilata; în acest caz, un tampon mic de vata de sticla este inserat la extremitatea inferioarã sl se impinge utilizând o bagheta de sticla.
4.4. Echipament HPCL cu sistem de injecţie, adecvat pentru injectarea de volume de 20 f2æl
4.4.1. Coloana pentru cromatografie lichidã: 300 mm x 4 mm, C18, umplere de 10 f2æm sau echivalenta
4.4.2. Detector UV cu lungime de unda variabila sau detector cu grup de diode ce funcţioneazã între 225 şi 400 nm
4.5. Filtru cu membrana de 0,22 f2æm
4.6. Filtru cu membrana de 0,45 æm
4.7. Baie cu ultrasunete
5. Procedura
NOTA:
Carbadoxul este fotosensibil. Toate procedurile se efectueazã în lumina estompata prin utilizarea de sticlarie de culoare bruna sau sticlarie ambalata în folie de aluminiu.
5.1. Generalitati
5.1.1. Furaj martor
Pentru efectuarea testului de recuperare (5.1.2) trebuie sa fie analizat un furaj martor, pentru a se verifica absenta carbadoxului şi a substanţelor interferente. Furajul martor trebuie sa fie de tip similar cu proba şi la analiza nu trebuie detectate nici carbadox şi nici substanţe interferente.
5.1.2. Test de recuperare
Testul de recuperare se efectueazã prin analizarea furajului martor (5.1.1) ce a fost imbogatit prin adãugarea unei cantitãţi de carbadox similare celei prezente în proba. Pentru obţinerea unei concentratii de 50 mg/kg se transfera 5,0 ml din soluţia etalon stoc (3.11.1) într-un balon conic de 200 ml. Se evapora soluţia de aproximativ 0,5 ml într-un curent de azot. Se adauga 10 g din furajul martor, se amesteca şi se asteapta timp de 10 minute înainte de a continua cu faza de extracţie (5.2).
Alternativ, dacã nu este disponibil un furaj martor de tip similar probei (vezi 5.1.1), poate fi efectuat un test de recuperare prin intermediul metodei de aditie a etalonului. În acest caz, proba trebuie imbogatita cu o cantitate de carbadox similarã celei deja prezente în proba. Aceasta proba se analizeazã împreunã cu proba neimbogatita şi recuperarea se calculeazã prin diferenţa.
5.2. Extractia
5.2.1. Furaje
Se cantaresc, cu o precizie de 0,01 g, aproximativ 10 g din proba şi se transfera într-un balon conic de 200 ml. Se adauga 15,0 ml de apa, se amesteca sl se echilibreaza timp de 5 minute. Se adauga 35,0 ml de metanol-acetonitril (3.5), se astupa şi se agita timp de 30 de minute cu agitatorul mecanic sau cu agitatorul magnetic (4.1). Se filtreaza soluţia printr-o hârtie de filtru din fibra de sticla (4.2). Se retine aceasta soluţie pentru faza de purificare (5.3).
5.2.2. Premixuri (0,1-2,0%)
Se cantareste, cu o precizie de 0,001 g, aproximativ 1 g din proba nemacinata şi se transfera într-un balon conic de 200 ml. Se adauga 15,0 ml de apa, se amesteca şi se echilibreaza timp de 5 minute. Se adauga 35,0 ml de metanol-acetonitril (3.5), se astupa şi se agita timp de 30 de minute cu un agitator mecanic sau cu un agitator magnetic (4.1). Se filtreaza soluţia printr-o hârtie de filtru din fibra de sticla (4.2). Se pipeteaza o parte alicota a filtratului într-un balon gradat de 50 ml. Se adauga 15,0 ml de apa, se aduce la semn cu metanol-acetonitril (3.5) şi se omogenizeaza. Concentratia de carbadox a soluţiei finale trebuie sa fie de aproximativ 10 f2æg/ml. O parte alicota este filtrata printr-un filtru de 0,45 æm (4.6). Se continua cu dozarea HPLC (5.4).
5.2.3. Preparate (>2%)
Se cantaresc, cu o precizie de 0,001 g, aproximativ 0,2 g din proba nemacinata şi se transfera într-un balon conic de 250 ml. Se adauga 45,0 ml de apa, se amesteca şi se echilibreaza timp de 5 minute. Se adauga 105,0 ml de metanol-acetonitril (3.5), se astupa şi se omogenizeaza. Proba se supune ultrasunetelor (4.7) timp de 15 minute, urmate de agitare mecanicã sau magnetica timp de 15 minute (4.1). Se filtreaza soluţia printr-o hârtie de filtru din fibra de sticla (4.2). Se dilueaza o parte alicota a filtratului cu amestecul de apa-metanol-acetonitril (3.12), pana la o concentraţie finala în carbadox de 10-15 f2æg/ml (pentru o preparare la 10%, factorul de dilutie este de 10). O parte alicota este filtrata printr-un filtru de 0,45 æm (4.6). Se continua cu determinarea HPLC (5.4).
5.3. Purificare
5.3.1. Prepararea coloanei de oxid de aluminiu
Se cantaresc 4 g de oxid de aluminiu (3.4) şi se transfera în coloana de sticla (4.3).
5.3.2. Purificarea probei
Se aplica 15 ml din extractul filtrat (5.2.1) în coloana de oxid de aluminiu şi se elimina primii 2 ml de eluant. Se colecteazã urmãtorii 5 ml şi se filtreaza o parte alicota printr-un filtru de 0,45 f2æm (4.6). Se continua cu determinarea HPLC (5.4).
5.4. Determinarea HPLC
5.4.1. Parametri
Urmãtoarele condiţii sunt oferite pentru orientare; pot fi utilizate alte condiţii numai dacã acestea dau rezultate echivalente.


     Coloana cromatografica               300 mm x 4 mm, C18,
     lichidã (4.4.1):                     umplere de 10 f2æm
                                          sau echivalenta
     Faza mobila (3.10):                  Amestec de soluţie tampon
                                          de acetat (3.9) şi acetonitril
                                          (3.2), 825 + 175 (v + v)
     Debit:                               1,5-2 ml/min.
     Lungimea undei de detectie:          365 nm
     Volum de injecţie:                   20 f2æl

Stabilitatea sistemului cromatografic se verifica prin injectarea de mai multe ori a soluţiei de etalonare (3.11.2) conţinând 5,0 f2æg/ml, pana când sunt obţinute înãlţimi (arii) ale picurilor şi timpi de retenţie constanti.
5.4.2. Curba de etalonare
Fiecare soluţie de etalonare (3.11.2) se injecteaza de mai multe ori şi se mãsoarã inaltimile (ariile) picurilor pentru fiecare concentraţie. Curba de etalonare se stabileşte prin utilizarea inaltimilor sau ariilor medii ale picurilor soluţiilor de etalonare ca ordonate şi a concentratiilor corespondente în f2æg/ml ca abcise.
5.4.3. Soluţia probei
Înãlţimea (aria) medie a picurilor carbadoxului se determina prin injectarea de mai multe ori a extractului probei [(5.3.2) pentru furaje, (5.2.2) pentru premixuri şi (5.2.3) pentru preparate].
6. Calculul rezultatelor
Concentratia soluţiei din proba în f2æg/ml prin referire la curba de etalonare (5.4.2) se determina plecand de la înãlţimea (aria) medie a picurilor carbadoxului soluţiei din proba.
6.1. Furaje:
Conţinutul w în carbadox (mg/kg) din proba se determina prin utilizarea urmãtoarei formule:


          f2δ x V(1)

în care:
f2δ = concentratia de carbadox a extractului din proba (5.2.2 sau 5.2.3) în f2æg/ml;
V(1) = volumul de extracţie în ml (adicã 50 ml);
m = masa porţiunii de test în g.

6.2. Premixuri şi preparate
Conţinutul w al probei în carbadox exprimat (mg/kg) se determina prin utilizarea urmãtoarei formule:


          f2δ x V(2) x f

în care:
f2δ = concentratia de carbadox a extractului din proba (5.2.2 sau 5.2.3) în f2æg/ml;
V(2) = volumul de extracţie în ml (adicã 50 ml pentru premixuri; 150 pentru preparate);
f = factor de dilutie conform 5.2.2 (premixuri) sau 5.2.3 (preparate);
m = masa porţiunii de test în g.

7. Validarea rezultatelor
7.1. Identitate
Identitatea substanţei de analizat poate fi confirmatã prin cocromatografie sau prin utilizarea unui detector cu grup de diode prin care sunt comparate spectrele extractului din proba şi ale soluţiei de etalonare (3.11.2) conţinând 10,0 f2æg/ml.
7.1.1. Cocromatografie
Un extract al probei este imbogatit prin adãugarea unei cantitãţi corespunzãtoare de soluţie de etalonare (3.11.2). Cantitatea de carbadox adãugat trebuie sa fie similarã cantitãţii estimate de carbadox constatatã în extractul din proba.
Înãlţimea picului carbadoxului poate sa fie marita dupã luarea în considerare atât a cantitãţii adãugate, cat şi a dilutiei extractului. Largimea picului, la jumãtatea inaltimii sale maxime, trebuie sa se situeze la ± 10% din largimea iniţialã.
7.1.2. Detectare cu grup de diode
Rezultatele se evalueaza conform urmãtoarelor criterii:
a) lungimea de unda de absorbţie maxima a spectrelor probei şi a etalonului, înregistratã la varful picului de cromatograma, trebuie sa fie aceeaşi într-o marja determinata de puterea de rezoluţie a sistemului de detectie. Pentru detectia prin grup de diode, aceasta este de obicei de ± 2 nm;
b) între 225 şi 400 nm, spectrele probei şi ale etalonului, înregistrate la varful picului pe cromatograma, trebuie sa fie identice pentru aceste pãrţi ale spectrului într-un interval de 10-100% al absorbantei relative. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt prezente aceleaşi maxime, iar deviatia dintre cele doua spectre nu depãşeşte 15% în niciun punct observat din absorbanta substanţei etalon de analizat;
c) între 225 şi 400 nm, spectrele curbei ascendente ale varfului şi ale curbei descendente a picului, produse de extractul din proba, trebuie sa fie identice pentru acele pãrţi ale spectrului într-un interval de 10-100% al absorbantei relative. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt prezente aceleaşi maxime şi când la toate punctele observate deviatia dintre spectre este de maximum 15% din absorbanta spectrului varfului.
Prezenta substanţei de analizat este conformã doar dacã toate criteriile sunt îndeplinite.
7.2. Repetabilitate
Pentru un conţinut de 10 mg/kg şi mai mare, diferenţa dintre rezultatele a doua determinãri paralele efectuate pe aceeaşi proba trebuie sa fie de cel mult 15% din rezultatul superior.
7.3. Recuperare
Pentru o proba (martor) imbogatita, recuperarea trebuie sa fie de minimum 90%.
8. Rezultate ale unui test de colaborare
A fost organizat un studiu de colaborare în care 6 furaje, 4 premixuri şi 3 preparate au fost analizate de 8 laboratoare. Au fost efectuate analize în dublu pentru fiecare proba. (Mai multe informaţii detaliate cu privire la acest studiu de colaborare pot fi gãsite în Jurnalul AOAC, volumul 71, 1988, pag. 484-490.) Rezultatele studiului (cu excepţia valorilor aberante) sunt indicate mai jos:

Tabelul 1. Rezultatele studiului de colaborare pentru furaje


 ┌────────────────┬─────────┬─────────┬─────────┬─────────┬─────────┬─────────┐
 │                │ Proba 1 │ Proba 2 │ Proba 3 │ Proba 4 │ Proba 5 │ Proba 6 │
 ├────────────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │L               │    8    │     8   │     8   │     8   │     8   │     8   │
 ├────────────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │n               │   15    │    14   │    15   │    15   │    15   │    15   │
 ├────────────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │Medie (mg/kg)   │  50,0   │   47,6  │   48,2  │   49,7  │   46,9  │   49,7  │
 ├────────────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │S(r)(mg/kg)     │  2,90   │   2,69  │   1,38  │   1,55  │   1,52  │   2,12  │
 ├────────────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │CV(r)(%)        │   5,8   │    5,6  │    2,9  │    3,1  │    3,2  │    4,3  │
 ├────────────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │S(R)(mg/kg)     │  3,92   │   4,13  │   2,23  │   2,58  │   2,26  │   2,44  │
 ├────────────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │CV(R)(%)        │   7,8   │    8,7  │    4,6  │    5,2  │    4,8  │    4,9  │
 ├────────────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤
 │Conţinut nominal│         │         │         │         │         │         │
 │(mg/kg)         │   50,0  │   50,0  │   50,0  │   50,0  │   50,0  │   50,0  │
 └────────────────┴─────────┴─────────┴─────────┴─────────┴─────────┴─────────┘

Tabelul 2. Rezultatele unui studiu de colaborare pentru premixuri şi preparate


 ┌─────────────────────────┬───────────────────────────────┬────────────────────┐
 │                         │           Premixuri           │      Preparate     │
 ├─────────────────────────┼───────┬───────┬───────┬───────┼──────┬──────┬──────┤
 │                         │   A   │    B  │   C   │   D   │   A  │   B  │   C  │
 ├─────────────────────────┼───────┼───────┼───────┼───────┼──────┼──────┼──────┤
 │L                        │    7  │    7  │    7  │    7  │   8  │   8  │   8  │
 ├─────────────────────────┼───────┼───────┼───────┼───────┼──────┼──────┼──────┤
 │n                        │   14  │   14  │   14  │   14  │  16  │  16  │  16  │
 ├─────────────────────────┼───────┼───────┼───────┼───────┼──────┼──────┼──────┤
 │Medie (g/kg)             │  8,89 │  9,29 │  9,21 │  8,76 │ 94,6 │ 98,1 │  104 │
 ├─────────────────────────┼───────┼───────┼───────┼───────┼──────┼──────┼──────┤
 │S(r)(g/kg)               │  0,37 │  0,28 │  0,28 │  0,44 │  4,1 │  5,1 │  7,7 │
 ├─────────────────────────┼───────┼───────┼───────┼───────┼──────┼──────┼──────┤
 │CV(r)(%)                 │   4,2 │   3,0 │   3,0 │   5,0 │  4,3 │  5,2 │  7,4 │
 ├─────────────────────────┼───────┼───────┼───────┼───────┼──────┼──────┼──────┤
 │S(R)(g/kg)               │  0,37 │  0,28 │  0,40 │  0,55 │  5,4 │  6,4 │  7,7 │
 ├─────────────────────────┼───────┼───────┼───────┼───────┼──────┼──────┼──────┤
 │CV(R)(%)                 │   4,2 │   3,0 │   4,3 │   6,3 │  5,7 │  6,5 │  7,4 │
 ├─────────────────────────┼───────┼───────┼───────┼───────┼──────┼──────┼──────┤
 │Conţinut nominal (g/kg)  │  10,0 │  10,0 │  10,0 │  10,0 │  100 │  100 │  100 │
 ├─────────────────────────┴───────┴───────┴───────┴───────┴──────┴──────┴──────┤
 │L:     numãr de laboratoare                                                   │
 │n:     numãr de valori unice                                                  │
 │s(r):  deviatie standard a repetabilitatii                                    │
 │CV(r): coeficient de variatie a repetabilitatii                               │
 │S(R):  deviatie standard a reproductibilitatii                                │
 │CV(R): coeficient de variatie a reproductibilitatii                           │
 └──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘

---------

Newsletter GRATUIT

Aboneaza-te si primesti zilnic Monitorul Oficial pe email

Tags: Monitorul Oficial, Acte Monitorul Oficial, Ordin, Autoritatea Nationala Sanitara Veterinara si Pentru Siguranta Animalelor, ORDIN nr. 24 din 1 februarie 2007

Comentarii

Fii primul care comenteaza.

MonitorulJuridic.ro este un proiect:

Atentie, Juristi!

5 modele Contracte Civile si Acte Comerciale - conforme cu Noul Cod civil si GDPR

Legea GDPR a modificat Contractele, Cererile sau Notificarile obligatorii

Va oferim Modele de Documente conform GDPR + Clauze speciale

Descarcati GRATUIT Raportul Special "5 modele Contracte Civile si Acte Comerciale - conforme cu Noul Cod civil si GDPR"