Comunica experienta
MonitorulJuridic.ro
-------- *)Ordinul nr. 89 din 5 februarie 2003 a fost publicat în Monitorul Oficial, Partea I, nr. 654 din 16 septembrie 2003. ANEXA 1 1. În baza articolului 1 al prezentului Ordin se aplică următoarele condiţii generale: - Natura şi obiectivele activităţilor pentru care este introdus sau deplasat materialul trebuie să fie examinate de către organismul oficial responsabil şi găsite în conformitate cu conceptul de experienţă, scop ştiinţific, sau experimental şi lucrări pe selecţii varietale prevăzute în Hotărârea Guvernului nr. 1.030/2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România; - Condiţiile de carantină a unităţilor şi instalaţiilor de la locul sau locurile în care se desfăşoară activităţile sunt inspectate de către organismul oficial responsabil pentru a fi în conformitate cu prevederile de la punctul 2, - Organismul oficial responsabil limitează cantitatea de material importat la un nivel corespunzător activităţilor aprobate, fără a se depăşi capacitatea instalaţiilor de carantină disponibile; - Calificarea ştiinţifică şi tehnică a personalului prin care se desfăşoară activităţile, trebuie să fie verificată şi aprobată de către organismul oficial responsabil. 2. În baza punctului 1, condiţiile de carantină a unităţilor şi instalaţiilor de la locul sau locurile de desfăşurare a activităţilor trebuie să fie suficiente pentru a asigura manipularea în siguranţă a materialului, astfel încât să fie eliminat riscul răspândirii organismelor dăunătoare. Pentru fiecare activitate specificată în cerere, organismul oficial responsabil determină riscul răspândirii organismelor dăunătoare ţinute în condiţii de carantină, ţinând cont de natura materialului şi de activitatea avută în vedere, de biologia organismului dăunător, de mijloacele de răspândire, de interacţiunea cu mediul şi de ceilalţi factori relevanţi legaţi de riscul prezentat de material. A. Ca rezultat al evaluării riscului, organismul oficial responsabil ia în calcul şi stabileşte, după caz, următoarele măsuri de carantină privind unităţile, instalaţiile şi procedurile de lucru: a) izolarea fizică a organismelor dăunătoare de orice alt material, inclusiv controlul vegetaţiei din zonele înconjurătoare; b) desemnarea unei persoane de contact responsabilă cu activităţile; c) accesul limitat în unităţi şi instalaţii precum şi în zona înconjurătoare, după caz, numai pentru personalul numit; d) identificarea unităţilor şi instalaţiilor corespunzătoare, indicând tipul activităţilor şi personalul autorizat; e) păstrarea unui registru al activităţilor desfăşurate şi a unui manual cu procedurile de operare, incluzând procedurile în cazul scăpării organismelor dăunătoare din carantină; f) sisteme adecvate de securitate şi alarmă; g) măsuri de control adecvate pentru prevenirea introducerii şi a răspândirii organismelor dăunătoare în unităţi; h) proceduri de control pentru eşantionarea şi transferul materialului între unităţi şi instalaţii; i) controlul eliminării deşeurilor, solului şi apei, după caz; j) proceduri şi instalaţii adecvate de igienă şi dezinfecţie pentru personal, unităţi şi echipament; k) măsuri şi instalaţii adecvate pentru eliminarea riscului prezentat de materialul experimental; l) proceduri şi instalaţii de indexare adecvate (incluzând testarea); şi B. Măsuri de carantină suplimentare, conforme cu biologia specifică şi epidemiologia tipului de material implicat în activităţile aprobate: a) păstrarea în instalaţii, în camere speciale, unde accesul personalului se face prin uşi duble; b) păstrarea în spaţii cu presiune negativă; c) izolarea în containere prevăzute cu pereţi din plasă, cu ochiuri de dimensiuni corespunzătoare şi alte bariere, de exemplu baraje lichide pentru acarieni, containere cu sol pentru nematozi, capcane electrice pentru insecte; d) păstrarea în condiţii de izolare de alte organisme dăunătoare şi de alte materiale infestate, de exemplu: substratul în care au crescut plantele atacate, plantele gazdă atacate; e) păstrarea materialului pentru înmulţire în cuşti de înmulţire cu mecanisme de manipulare; f) evitarea încrucişării organismelor dăunătoare cu tulpini sau specii indigene; g) evitarea creşterii permanente a organismelor dăunătoare; h) păstrarea în condiţii prin care se controlează strict multiplicarea organismelor dăunătoare, de exemplu, într-un mediu de inhibare a diapauzei; i) păstrarea în aşa fel încât să nu aibă loc răspândirea prin mijloace de propagare, de exemplu, evitarea curenţilor de aer; j) proceduri de verificare a purităţii culturilor de organisme dăunătoare pentru a le păstra libere de paraziţi şi alte organisme dăunătoare; k) program adecvat de control al materialului pentru a elimina posibilii vectori; l) pentru activităţile în vitro, manevrarea materialului în condiţii sterile: echiparea laboratorului pentru executarea procedurilor în condiţii aseptice; m) păstrarea organismelor, care se răspândesc prin vectori, în condiţii care să prevină răspândirea prin intermediul vectorilor, de exemplu folosirea de plase cu ochiuri de dimensiuni controlate, izolarea solului; n) izolarea în funcţie de sezon, astfel încât activităţile să fie efectuate în perioadele cu risc fitosanitar scăzut. ANEXA 2
ROMÂNIA SCRISOARE DE AUTORIZARE
LETTER OF AUTHORITY
┌────────────────────────────────────────┬─────────────────────────────────────────────────┐
│1. Numele şi adresa │ Scrisoare de autorizare │
│expeditorului/Organizaţia de │ │
│protecţia plantelor din ţara de origine │Pentru introducerea şi/sau punerea în circulaţie │
│Name and address of the consignor/Plant │a organismelor dăunătoare, plantelor, produselor │
│protection organization of the country │ vegetale sau articolelor reglementate pentru │
│of origin │experienţe, scopuri ştiinţifice sau experimentele│
│ │ şi pentru lucrări pe selecţii varietale │
│ │ │
├────────────────────────────────────────┤ Letter of authority │
│2. Numele şi adresa persoanei competente│ │
│pentru activităţile aprobate/Name and │ For the introduction and/or movement of │
│address of the person responsible for │harmful organisms, plants, plant products and │
│the approved activities: │ other objects for trial or scientific │
│ │ purposes and for work on varietal selections │
│ ├─────────────────────────────────────────────────┤
│ │3. Numele organului oficial competent/Name of the│
│ │responsible official body: │
│ │ │
├────────────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤
│4. Adresa şi descrierea locului sau │5. Locul de origine (dovada documentară anexată │
│locurilor specifice pentru deţinerea în │pentru materialele originare dintr-o altă ţară)/ │
│carantină/Address and description of │Place of origin (documentary evidence attached │
│the specific site or sites for │for material originating în a third country): │
│quarantine containement: │ │
│ ├─────────────────────────────────────────────────┤
├────────────────────────────────────────┤6. Numărul de paşaport al plantei/Plant passport │
│7. Punctul de intrare declarat pentru │number: │
│materialul introdus dintr-o altă │ │
│ţară/Declared point of entry for │sau/or │
│material introduced from a third │Numărul certificatului fitosanitar/Phytosanitary │
│country: │certificate number: │
├────────────────────────────────────────┴─────────────────────────────────────────────────┤
│8. Denumirea(ile) ştiinţifică(e) a(le) materialului, │9. Cantitatea de material/│
│inclusiv organismele dăunătoare respective/Scientific name(s) │Quantity of material: │
│of the material, including the harmful organisms concerned: │ │
│ │ │
├───────────────────────────────────────────────────────────────┴──────────────────────────┤
│10. Tipul de material/Type of material: │
│ │
├──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┤
│11. Declaraţia suplimentară/Additional declaration: │
│ │
│ Acest material este introdus/pus în circulaţie în*1) România, conform legislaţiei │
│ în vigoare/ │
│ This material is introduced into/moved within*1) România, under the applicable law │
├──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┤
│12. Informaţii suplimentare/Additional information: │
│ │
├───────────────────────────────────┬──────────────────────────────────────────────────────┤
│13. Avizarea materialului de către │14. Ştampila organismului oficial responsabil emitent/│
│organismul oficial responsabil din │Stamp of the responsible official body of issue: │
│locul de origine/Endorsement by the│ │
│responsible official body în the │ │
│place of origin │ │
│ Locul avizării/Place of │Locul eliberării/Place of issue: │
│ endorsement: │ │
│ Data/Date: │Data/Date: │
│ │ │
│Numele şi semnătura funcţionarului │Numele şi semnătura funcţionarului autorizat/ │
│autorizat/ │Name and signature of authorized officer: │
│Name and signature of authorized │ │
│officer: │ │
└───────────────────────────────────┴──────────────────────────────────────────────────────┘
NB: Rubricile sau zonele colorate în gri nu se completează/The requirements în gray
are not applicable.
---------
*1) Se taie unde nu este aplicabil/Delete if not applicable.
ANEXA 3
ROMÂNIA SCRISOARE DE AUTORIZARE
LETTER OF AUTHORITY
┌─────────────────────────────────────────────┬─────────────────────────────────────────────┐
│1. Numele şi adresa expeditorului/Organizaţia│ Scrisoare de autorizare │
│de protecţia plantelor din ţara de origine │ │
│Name and address of the consignor/Plant │Pentru introducerea şi/sau punerea în │
│protection organization of the country │circulaţie a organismelor dăunătoare, │
│of origin: │plantelor, produselor vegetale sau │
│ │articolelor reglementate pentru │
│ │experienţe, scopuri ştiinţifice sau │
│ │experimentele şi pentru lucrări pe selecţii │
│ │varietale │
├─────────────────────────────────────────────┤ Letter of authority │
│2. Numele şi adresa persoanei competente │ │
│pentru activităţile aprobate/Name and address│For the introduction and/or movement of │
│of the person responsible for the approved │harmful organisms, plants, plant products and│
│activities: │ other objects for trial or scientific │
│ │purposes and for work on varietal selections │
│ ├─────────────────────────────────────────────┤
│ │3. Numele organului oficial competent/Name │
│ │of the responsible official body │
│ │ │
├─────────────────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────────────┤
│4. Adresa şi descrierea locului sau locurilor│5. Locul de origine (dovada documentară │
│specifice pentru deţinerea în │anexată pentru materialele originare dintr-o │
│carantină/Address and description of the │altă ţară)/Place of origin (documentary │
│specific site or sites for quarantine │evidence attached for material originating │
│containement: │în a third country): │
│ ├─────────────────────────────────────────────┤
├─────────────────────────────────────────────┤6. Numărul de paşaport al plantei/Plant │
│7. Punctul de intrare declarat pentru │passport number: │
│materialul introdus dintr-o altă ţară/ │ │
│Declared point of entry for material │sau/or │
│introduced from a third country: │Numărul certificatului fitosanitar/ │
│ │Phytosanitary certificate number: │
├─────────────────────────────────────────────┴─────────────────────────────────────────────┤
│8. Denumirea(ile) ştiinţifică(e) a(le) materialului, inclusiv │9. Cantitatea de material/│
│organismele dăunătoare respective/Scientific name(s) of the │Quantity of material: │
│material, including the harmful organisms concerned: │ │
│ │ │
├────────────────────────────────────────────────────────────────┴──────────────────────────┤
│10. Tipul de material/Type of material: │
│ │
├───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┤
│11. Declaraţia suplimentară/Additional declaration: │
│ │
│Acest material este introdus/pus în circulaţie în*1)România, conform legislaţiei în vigoare│
│ This material is introduced into/moved within*1) România, under the applicable law │
├───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┤
│12. Informaţii suplimentare/Additional information: │
│ │
├──────────────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────────────┤
│13. Avizarea materialului de către organismul │14.Ştampila organismului oficial responsabil│
│oficial responsabil din ţara de origine/ │emitent/Stamp of the responsible official │
│Endorsement by the responsible official body │ body of issue: │
│în the country of origin │ │
│ Locul avizării/Place of endorsement: │Locul eliberării/Place of issue: │
│ │ │
│ Data/Date: │Data/Date: │
│ │ │
│ Numele şi semnătura funcţionarului │Numele şi semnătura funcţionarului autorizat│
│ autorizat/ Name and signature of authorized │Name and signature of authorized officer: │
│ officer: │ │
└──────────────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────────────┘
NB: Rubricile sau zonele colorate în gri nu se completează/The requirements în gray are
not applicable.
---------
*1) Se taie unde nu este aplicabil/Delete if not applicable.
ANEXA 4 MĂSURI DE CARANTINĂ, INCLUSIV TESTAREA MATERIALULUI DESTINAT SCOATERII DIN CARANTINĂ PARTEA A Pentru anumite materiale enumerate în Anexa 3 a Hotărârii Guvernului nr. 1.030/2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România. Secţiunea 1 Plante de Citrus L, Fortunella Swingle, Poncirus Raf. şi hibrizii acestora, altele decât fructele şi seminţele 1. Materialul, după caz, se supune procedurilor adecvate de terapie prevăzute în Ghidul tehnic FAO/IPGRI. 2. Materialul, urmând procedurile de terapie menţionate la punctul 1, este indexat. Întregul material, inclusiv plantele pentru indexare, se păstrează în instalaţiile aprobate, în condiţiile de izolare în carantină, menţionate în Anexa 1. Materialul destinat aprobării pentru scoaterea din carantină se păstrează în condiţii care să permită un ciclu normal de vegetaţie şi se supune inspecţiei vizuale, la sosire şi ulterior, la momente potrivite, pe durata indexării, în vederea identificării semnelor şi simptomelor produse de organisme dăunătoare, inclusiv de toate organismele dăunătoare relevante enumerate în Hotărârea Guvernului nr. 1.030/2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de caran tină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România. 3. Conform punctului 2, materialul este indexat (testat şi identificat) pentru organisme dăunătoare, respectând următoarelor proceduri: 3.1. Testarea este efectuată prin metode adecvate de laborator şi când este cazul, plante indicator, inclusiv Citrus sinensis (L.) Osbeck, C. aurantifolia Christm. Swing, C. medica L., C. reticulata Blanco şi Sesamum L., pentru a detecta cel puţin următoarele organisme dăunătoare: a) Citrus greening bacterium b) Citrus variegated chlorosis c) Citrus mosaic virus d) Citrus tristeza virus (toate izolatele) e) Citrus vein enation woody gall f) Leprosis g) Naturally spreading psorosis h) Phoma tracheiphila (Petri) Kanchaveli & Gikashvili i) Satsuma dwarf virus j) Spiroplasma citri Saglio et al k) Tatter leaf virus i) Witches broom (MLO) m) Xanthomonas campestris (toate tulpinile patogene la Citrus) 3.2. Pentru boli precum "Blight and blight like", pentru care nu se poate face indexarea rapidă, materialul trebuie supus, la sosire, testării prin grefarea mugurelui terminal pe un portaltoi crescut în cultură sterilă, conform cu Ghidul tehnic al FAO/IPGRI, iar plantele rezultate se supun procedurilor de terapie prevăzute la pct. 1. 4. Materialul supus inspecţiilor vizuale la care se referă punctul 2 şi la care s-au observat semnele şi simptomele produse de organismele dăunătoare este supus unei investigaţii incluzând testarea, când este cazul, pentru identificarea cât mai rapidă a organismelor dăunătoare care au cauzat semnele şi simptomele respective. Secţiunea 2 Plantele de Cydonia Mill, Malus Mill, Prunus L. şi Pyrus L. şi hibrizii acestora şi Fragaria L., destinate plantării, altele decât seminţele 1. Materialul se supune, după caz, procedurilor adecvate de terapie prevăzute în Ghidul tehnic al FAO/IPGRI. 2. Materialul, urmând procedurile de terapie prevăzute la punctul 1, se supune procedurilor de indexare în totalitatea sa. Întregul material, inclusiv plantele pentru indexare, se păstrează în instalaţii, în condiţiile de carantină menţionate la Anexa 1. Materialul care trebuie aprobat pentru scoaterea din carantină se păstrează în condiţii favorabile apariţiei semnelor şi simptomelor de organisme dăunătoare, inclusiv toate organismele dăunătoare relevante listate în Hotărârea Guvernului numărul 1.030 /2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România, la sosire şi ulterior, la momentele potrivite, în timpul procedurilor de indexare. 3.1. Conform punctului 2, materialul se indexează pentru depistarea organismelor dăunătoare (testare şi identificare), după următoarele proceduri: 3.2. Pentru Fragraria L., indiferent de ţara de origine a materialului, pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator şi, când este cazul, plante indicator, inclusiv Fragraria vesca, F. virginiana şi Chenopodium spp. pentru a detecta cel puţin următoarele organisme dăunătoare: a) Arabis mosaic virus b) Raspberry ringspot virus c) Strawberry crinkle virus d) Strawberry latent "C" virus e) Strawberry latent ringspot virus f) Strawberry mild yellow edge virus g) Strawberry vein banding virus h) Strawberry witches' broom MLO i) Tomato black ring virus j) Tomato ringspot virus k) Colletotrichum acutatum Simmonds l) Phytophthora fragariae Hickman var. fragariae Wilcox & Duncan m) Xanthomonas fragariae Kennedy & King 3.2.1. În cazul Malus Mill: când materialul provine dintr-o ţară care nu este cunoscută a fi liberă de unul din următoarele organisme dăunătoare: a) Apple proliferation mycoplasm; sau b) Cherry rasp leaf virus (American), pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator şi, când este cazul, plante indicator pentru detectarea organismelor dăunătoare relevante şi, 3.2.2. Indiferent de ţara de origine a materialului, pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator şi, când este cazul, plante indicator pentru detectarea a cel puţin următoarelor organisme dăunătoare: a) Tobacco ringspot virus b) Tomato ringspot virus c) Erwinia amylovora (Burr.) Winsl. Et al. 3.3. Pentru Prunus L., după caz, pentru fiecare specie de Prunus: (1) Când materialul este originar dintr-o ţară care nu este cunoscută a fi liberă de oricare din următoarele organisme dăunătoare: a) Apricot chlorotic leafroll mycoplasm; b) Cherry rasp leaf virus (American); sau c) Pseudomonas syringae pv. persicae (Prunier et al.) Young et al., pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator şi, când este cazul, plante indicator pentru detectarea organismelor dăunătoare relevante şi (2) Indiferent de ţara de origine a materialului, pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator şi, când este cazul, plante indicator pentru a detecta cel puţin următoarele organisme dăunătoare: a) Little cherry pathogen (izolate non-Europene) b) Peach mosaic virus (American) c) Peach phony rickettsia d) Peach rosette mosaic virus e) Peach rosette mycoplasm f) Peach X disease mycoplasm g) Peach yellows mycoplasm h) Plum line pattern virus (American) i) Plum pox virus j) Tomato ringspot virus k) Xanthomonas camperesis pv. pruni (Smith) Dye. 3.4. În cazul Cydonia Mill şi Pyrus L., indiferent de ţara de origine a materialului, pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator, şi, când este cazul, plante indicator, pentru a detecta cel puţin următoarele organisme dăunătoare: a) Erwinia amylovora (Burr.) Winsl. Et al. b) Pear decline mycoplasm 4. Materialul supus inspecţiilor vizuale menţionate la punctul 2 şi la care s-au observat semne şi simptome produse de organismele dăunătoare, se supune unei investigaţii, incluzând testarea când este cazul, pentru identificarea organismelor dăunătoare ce au cauzat semnele şi simptomele respective. Secţiunea 3 Plantele de Vitis L., altele decât fructele 1. Materialul se supune, după caz, procedurii adecvate de terapie, prevăzute în Ghidul tehnic al FAO/IPGRI. 2. (1) Materialul, urmând procedurile de terapie menţionate la punctul 1, se supune procedurilor de indexare în totalitatea sa. (2) Întregul material, inclusiv plantele pentru indexare, se păstrează în instalaţiile aprobate, în condiţiile de carantină specificate în Anexa 1. (3) Materialul destinat aprobării pentru scoaterea din carantină se păstrează în condiţii care să permită un ciclu vegetativ normal şi va fi supus inspecţiei vizuale efectuate la sosire şi ulterior, la momente potrivite, în timpul perioadei procedurilor de indexare, pentru detectarea semnelor şi simptomelor produse de organismele dăunătoare, inclusiv cele cauzate de Daktulosphaira vitifoliae (Fitch) şi ale tuturor celorlalte organisme dăunătoare relevante listate în Hotărârea Guvernului numărul 1.030 /2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România. Conform punctului 2, materialul se indexează pentru testarea şi depistarea organismelor dăunătoare (testat şi identificat) în conformitate cu următoarele proceduri: 3. Pentru materialul care provine dintr-o ţară care nu este cunoscută ca fiind liberă de următoarele organisme dăunătoare: a) Boala Ajinashika. Pentru testare se foloseşte o metodă adecvată de laborator iar, în cazul unui rezultat negativ, materialul vegetal va fi altoit pe soiul Koshu şi ţinut sub observaţie cel puţin două cicluri de vegetaţie. b) Grapevine stunt virus. Pentru testare se folosesc plante indicator adecvate, inclusiv soiul Campbell Early, iar observaţiile se fac timp de un an. c) Summer mottle. Pentru testare se folosesc plante indicator adecvate, inclusiv soiurile Sideritis, Cabernet-Franc şi Mission. Indiferent de ţara de origine a materialului, pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator şi, când este cazul, plante indicator pentru detectarea cel puţin următoarele organisme dăunătoare: (a) Blueberry leaf mottle virus (b) Grapevine flavescence doree MLO şi altele (Grapevine yellows) (c) Peach rosette mosaic virus (d) Tobacco ringspot virus (e) Tomato ringspot virus (suşa "yellow vein" şi alte suşe) (f) Xylella fastidiosa (Well & Raju) (g) Xylophilus ampelinus (Panagopoulos) Willems et al. 4. Materialul supus inspecţiei vizuale prevăzută la punctul 2 şi pe care au fost observate semne şi simptome de organisme dăunătoare se supune unei investigaţii care să includă testarea, unde este necesar, pentru a determină cât mai rapid posibil identitatea organismelor dăunătoare care cauzează semnele şi simptomele. Secţiunea 4 Plante ale speciei Solanum L. care formează stoloni sau tuberculi sau hibrizii lor, destinate plantării 1. Materialul, după caz, se supune procedurilor de tratament prevăzute în Ghidul Tehnic FAO/IPGRI. 2. (1) Se indexează fiecare unitate a materialului, urmând procedurile de tratament prevăzute la punctul 1. (2) Întregul material, inclusiv plantele pentru indexare, se păstrează în instalaţiile aprobate, în condiţiile de carantină prevăzute în Anexa 1. (3) Materialul destinat scoaterii din carantină se păstrează în condiţii care să permită un ciclu normal de creştere vegetativă şi se inspectează vizual pentru semne şi simptome produse de organismele dăunătoare, inclusiv de toate organismele dăunătoare relevante listate în Hotărârea Guvernului numărul 1.030/2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România şi Potato yellow vein disease, la sosire şi ulterior, la intervale regulate, până la sfârşitul ciclului vegetativ, pe toată perioada procedurilor de indexare. 3. Procedurile de indexare menţionate la punctul 2 urmează prevederile tehnice de la punctul 5, pentru a detecta cel puţin următoarele organisme dăunătoare: A. - Bacterii a) Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al ssp. Sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al; b) Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, cunoscută şi sub numele de Ralstonia solanacearum (Smith) Smith. B. - Virusuri şi organisme analoage a) Andean potato latent virus, b) Potato black ringspot virus, c) Potato spindle tuber viroid, d) Potato yellowing alfamovirus, e) Potato virus T, f) Andean potato mottle virus, g) Common potato viruses A, M, S, V, X şi Y (incluzând Y(5), Yn şi Yc) şi Potato leaf roll virus. În cazul seminţei de cartof, procedurile de indexare se aplică pentru a detecta cel puţin virusurile şi organismele asemănătoare virusurilor listate mai sus de la a) la e) 4. Materialul supus inspecţiilor vizuale menţionate la punctul 2 şi la care se observă semne şi simptome produse de organismele dăunătoare, se supune unei investigaţii, incluzând testarea când este cazul, pentru identificarea organismelor dăunătoare care au cauzat semnele şi simptomele respective. 5. Prevederile tehnice menţionate la punctul 3 sunt următoarele: A. - Bacterii a) Pentru tuberculi, se testează ţesutul din jurul punctului de inserţie al fiecărui tubercul, mărimea probei standard fiind de 200 tuberculi, procedura putând fi aplicată convenabil şi pentru probele cu mai puţin de 200 tuberculi. b) Pentru plantele ţinere şi butaşi, inclusiv micro-plante, se testează partea bazală a tulpinii şi când este cazul, rădăcinile, pentru fiecare unitate a materialului. c) Testarea tuberculilor nou formaţi, sau a bazei tulpinii, pentru speciile care nu formează tuberculi, este recomandată pentru un ciclu normal de creştere vegetativă care urmează testării menţionate la punctul a şi b. d) Pentru materialul menţionat la punctul a, în vederea testării metoda de testare pentru Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) David et al. se foloseşte metoda descrisă în secţiunea 5 a prezentei Anexe. Pentru materialul menţionat la punctul b, poate fi aplicată aceeaşi metodă de testare. e) Pentru materialul menţionat la punctul a, în vederea testării pentru Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, Ralstonia solanacearum (Smith) Smith, se aplică metodele aprobate prin Ordin al Ministrului Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor. B. - Virusuri şi organisme analoage virusurilor, altele decât Potato spindle tuber viroid. a) Testarea minimă pentru tuberculi, plante ţinere şi butaşi, incluzând micro-plante, include un test serologic făcut la sau aproape de înflorire pentru fiecare din organismele dăunătoare listate, altele decât Potato spindle tuber viroid, urmat de un test biologic al materialului găsit negativ la testul serologic, b) Pentru Potato leaf roll virus, se fac două teste serologice. c) Testarea minimă pentru sămânţa de cartof constă într-un test serologic sau biologic, dacă nu este disponibil unul serologic. Pentru probele găsite negative se recomandă retestarea unei părţi din probe; pentru rezultatele incerte, se face testarea materialului prin altă metodă. d) Testările serologice şi biologice menţionate la punctul 5 B(a)(b)(c) vor fi făcute pe plante crescute în seră, pe probe luate din cel puţin două poziţii de pe fiecare tulpină, incluzând o frunză tânără întreagă din vârful fiecărei tulpini şi o frunză mai veche de la mijlocul tulpinii. Trebuie ridicate probe din fiecare tulpină datorită posibilei existenţe a unei infecţii nesistemice. În cazul testelor serologice, proba de analizat trebuie să fie formată din frunze prelevate de pe aceeaşi plantă. Nu se recomandă amestecarea frunzelor prelevate de la mai multe plante decât dacă proporţia de amestec a fost validată printr-o metodă specială. În cazul testărilor biologice, proba este formată din frunze prelevate de la maxim cinci plante cu inocularea a cel puţin două plante din fiecare specie indicator. e) Plantele indicator adecvate pentru folosire în testarea biologică menţionată la punctul 5 B(a), (c) sunt cele listate de către Organizaţia Europeană şi Mediteraneană pentru Protecţia Plantelor (OEPP), sau alte plante indicator aprobate oficial, despre care s-a dovedit că detectează virusurile respective. f) Se scoate din carantină numai materialul care a fost direct testat. După efectuarea testării ochiurilor, se scoate din carantină numai materialul (plantulele) rezultat din tuberculii analizaţi. Nu este permisă scoaterea din carantină a tuberculului ca atare din cauza posibilelor probleme cu infecţiile nonsistemice. C. - Potato spinale tuber viroid a. (1) Pentru întregul material, se testează plante cultivate în seră, de îndată ce s-au acomodat bine, dar înainte de înflorire şi producerea polenului. (2) Testarea lăstarilor tuberculilor, a plantulelor crescute în vitro sau a răsadurilor ţinere este privită numai ca o testare preliminară. b. Probele se alcătuiesc dintr-o frunză complet dezvoltată din vârful fiecărei tulpini a plantei. c. Întregul material pentru testare se cultivă la temperaturi care să nu fie mai mici de 18°C (preferabil la temperaturi mai mari de 20°C) şi la o fotoperioadă de cel puţin 16 ore. d. Testarea probelor de ADN şi ARN se face prin marcare radioactivă sau neradioactivă, return-PAGE (prin colorare cu Ag) sau prin RT-PCR. e. Proporţia maximă de amestecare pentru alcătuirea unei probe şi return-PAGE este de cinci plante, iar utilizarea acesteia sau a proporţiilor mai mari trebuie validată. Secţiunea 5 Metoda pentru detectarea şi diagnosticarea bacteriei care provoacă putregaiul inelar al cartofului, Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. Sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Davis et al. în loturile de tuberculi de cartofi 1. Prelevarea conurilor. 1.1. Se spală 200 de tuberculi în apa de la robinet şi de îndepărtează epiderma din jurul punctului de inserţie al fiecărui tubercul de cartof, folosind un bisturiu sau un cuţit de curăţat cartofi, dezinfectat periodic; dezinfecţia de poate face prin înmuierea cuţitului în soluţie de ethanol 70% înainte de flambare. 1.2. a) Se scot cu grijă conuri de ţesut din punctul de inserţie al cartofului cu un bisturiu sau un cuţit de cartofi, evitându-se prelevarea de ţesut nevascular în exces. b) După scoatere, conurile trebuie: prelucrate în maxim 24 de ore (v. paragraful 3) sau păstrate timp de maxim două săptămâni, la o temperatură de -20° C. 2. Examinarea vizuală a simptomelor veştejirii bacteriene. După scoaterea conurilor, se secţionează fiecare tubercul şi se caută prezenţa simptomelor de putregai inelar. Se storc tuberculi şi se urmăreşte dacă din ţesutul vascular exudează ţesuturi macerate. Simptomele timpurii se prezintă sub forma unui aspect uşor sticlos sau translucid a ţesutului, fără înmuiere în jurul ţesutului vascular; aceste simptome în special în punctul de inserţie al tuberculului. Inelul vascular poate prezenta, la punctul de inserţie, o culoare uşor mai închisă decât cea normală. Primele simptome uşor identificabile apar sub forma unei coloraţii gălbui a inelului vascular. Când tuberculul este presat uşor, din vase se elimină un exudat cu un aspect brânzos. Acest exudat conţine milioane de bacterii şi, în această fază, se poate produce o colorare brună a ţesutului vascular. La început, aceste simptome pot apărea doar pe o parte a inelului, nu neapărat în apropierea punctului de inserţie, şi apoi se extind treptat pe tot inelul. Pe măsură ce infecţia avansează, ţesuturile vasculare sunt distruse şi cortexul extern se poate separa de cel intern. În stadiile avansate ale infecţiei, apar crăpături la suprafaţa tuberculului, având adesea o culoare brun-roşiatică pe margini. Simptomele pot fi mascate de invazii fungice sau bacteriene secundare şi este foarte dificil, dacă nu imposibil, să se distingă simptomele avansate ale putregaiului inelar de celelalte putregaiuri ale tuberculului. 3. Pregătirea probelor pentru coloraţia Gram, colorarea prin imunofluorescenţă (IF) şi testul pe vinete 3.1. Se omogenizează conurile până la macerare completă într-un diluant cunoscut ca fiind netoxic pentru Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (de exemplu tampon fosfat salin 0.05 M (TFS) de 0.05 M şi pH 7.0), la o temperatură mai mică de 30 de grade C. Se recomandă adăugarea unui defloculant netoxic şi a unui agent antispumant netoxic (apendice 1 şi 2). Trebuie evitată o macerare excesivă. 3.2 Se extrag bacteriile din amestecul omogen prin una din metodele următoare*1):------------ *1) O metodă de extracţie alternativă este dată de Dinesen, 1984. A. a) Se centrifughează la nu mai mult de 180 g timp de 10 minute; b) Se centrifughează supernatantul la nu mai puţin de 4000 g timp de 10 minute. Se lasă la decantat, iar apoi supernatantul se elimină. B. a) Se lasă maceratul în repaus timp de 30 de minute pentru ca resturile de ţesut să se poată depune. Se decantează supernatantul fără a tulbura sedimentul. b) Se filtrează supranatantul printr-un filtru de hârtie (Whatman nr. 1) ţinut într-un filtru de sticlă poroasă (nr. 2 = 40 - 100 мm) folosind o pompă de vacuum adaptată la sursa de apă. Se colectează filtratul într-un tub de centrifugă. Se spală filtrul cu tampon fosfat salin steril până la obţinerea unui volum maxim al filtratului de 35 ml. c) Se centrifughează filtratul la nu mai puţin 4000 g timp de 20 de minute. 3.3. Se suspendă depozitul în tampon fosfat salin steril 0.01 M, ph 7.2 (apendice 2) până la obţinerea unui volum total de aproximativ 1 ml. Se divizează în două părţi egale şi se păstrează o parte în scopuri de referinţă prin congelare la -20°C*1) sau prin liofilizare. Cealaltă jumătate se divizează în două părţi egale, utilizând una pentru testul IF şi coloraţia Gram şi cealaltă pentru testul vinetei.----------- *1) Există dovada (Jansr şi Van Varrenberg, 1987) că prin congelare se poate reduce viabilitatea lui C.m. spp. Sepedonicus. Se recomandă suspensia depozitului în soluţie de glicerol 10%. 3.4. Pentru a evita orice contaminare, este obligatoriu ca martorii pozitivi de C.m. ssp. sepedonicus şi probele să fie tratate separat, atât pentru testul de IF cât şi pentru testul vinetei. 4. Coloraţia Gram 4.1. Se prepară coloraţii Gram pentru toate diluţiile depozitului (punctul 5.2.1.) şi pentru tuberculii tăiaţi (punctul 2) care prezintă simptome de putregai inelar sau alte simptome suspecte. Probele se prelevează de pe marginea ţesuturilor bolnave. 4.2. Se prepară coloraţii Gram pentru culturile cunoscute de C.m. spp. sepedonicus şi, dacă este posibil, şi pentru ţesuturile infectate natural (punctul 5.1). 4.3. Se identifică probele care conţin celule corineforme tipice, Gram pozitive. În general, celulele de C.m. spp. sepedonicus au o lungime de 0,8 până la 1,2 мm şi o lăţime de 0,4 până la 0,60 um. În apendicele 3 se indică un procedeu de colorare adecvat. Preparatele din infecţii naturale sau culturi recent izolate prezintă adesea o predominanţă de bastonaşe cocoide, care sunt de obicei mai mici decât celulele din culturile mai vechi însămânţate pe mediu de agar. În majoritatea mediilor de cultură, celulele de C.m. spp. sepedonicus se prezintă ca nişte bastonaşe corineforme pleomorfe şi pot da o reacţie Gram variabilă. Celulele sunt unice, în perechi cu "coturi" caracteristice, tipice pentru divizarea corinebacteriilor şi, ocazional, în grupuri neregulate asemenea unor palisade şi litere chinezeşti. 5. Protocol pentru testarea IF 5.1. Se utilizează un antiser pentru o tulpină cunoscută de C.m. spp. sepedonicus - ATCC 33113 (NCPPB 2137) sau NCPPB 2140. Aceasta trebuie să aibă un titru IF mai mare de 1:600. Se include un control TFS pe lama de testare pentru a se determina dacă imunoglobulina anti-iepure conjugată cu izotiocianat de fluoresceină (ITCF) se combină nespecific cu celulele bacteriene. C.m. spp. sepedonicus (ATCC 33113 (NCPPB 2137), NCPPB 2140) ar trebui utilizat ca şi control de antigen omolog pe o lamă separată. Ţesutul infectat natural (conservat prin liofilizare sau congelare la -20°C) se utilizează, dacă este posibil, ca un control similar pe aceeaşi lamelă (figura 2). 5.2. Procedeul 5.2.1. Din depozitul-final, se prepară trei serii de diluţii (10θ, 10κ, 10â) în apă distilată (figura 1). 5.2.2. Din fiecare diluţie a depozitului său din fiecare suspensie de C.m. spp. sepedonicus (aproximativ 10^6 celule/ml), se pipetează un volum standard măsurat, suficient pentru a acoperi godeul (aproximativ 25 мl), în godeurile unei lame cu spoturi multiple după cum se prezintă în figura 1. 5.2.3. Se lasă la uscat la o temperatură de aproximativ 37°C şi se fixează cu soluţie de etanol 95% sau prin flambare. Figura 1 Lamela de control cu mostră şi tampon fosfat salin-------------- NOTĂ(CTCE) Figura 1 - Lamela de control cu mostră şi tampon fosfat salin - se găseşte în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 654 bis din 16 septembrie 2003, la pagina 26 (a se vedea imaginea asociată). Figura 2 Lama de control pozitiv-------------- NOTĂ(CTCE) Figura 2 - Lama de control pozitiv - se găseşte în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 654 bis din 16 septembrie 2003, la pagina 27. (a se vedea imaginea asociată). 5.2.4. Se acoperă godeurile respective cu antiser pentru C.m. spp. sepedonicus la diluţiile recomandate, TFS de 0.01, pH 7.2, conform figurii 1. (Se utilizează TFS pentru controlul ITCF). Diluţia de lucru a antiserului trebuie să fie egală cu aproximativ jumătate din titrul IF. Dacă trebuie folosite alte diluţii antiser, se pregătesc lame separate pentru fiecare diluţie ce urmează a fi utilizată. 5.2.5. Se incubează într-o cameră umedă, la temperatura ambiantă, timp de 30 de minute. 5.2.6. Se clăteşte cu grijă cu TFS de 0,01 M şi pH 7,2. Se spală timp de 5 minute în trei reprize cu TFS 0,01 M şi pH 7,2, schimbându-se de fiecare dată soluţia de spălare. 5.2.7. Se elimină cu grijă excesul de umezeală. 5.2.8. Se acoperă fiecare godeu cu conjugat ITCF în aceeaşi diluţie utilizată pentru determinarea titrului şi se incubează într-o cameră umedă întunecoasă, la temperatura ambiantă, timp de 30 de minute. 5.2.9. Se clăteşte şi se spală ca mai înainte. 5.2.10. În fiecare godeu, se pun 5 până la 10 мl de glicerină tamponată cu fosfat 0.1 M, cu pH 7,6 (sau o valoare similară cu un pH de minimum 7,6) şi se acoperă cu o lamelă (apendice 2). 5.2.11. Se examinează cu un microscop prevăzut cu o sursă de lumină epifluorescentă şi filtre adecvate pentru ITCF. Se recomandă folosirea unui obiectiv cu o putere de mărire de 400x până la 1000x. Se scanează fiecare godeu replicat de-a lungul a două diametre perpendiculare şi de-a lungul perimetrului acestuia. Se observă celulele fluorescente din controalele pozitive şi se determină titrul acestora. Se observă celulele fluorescente din godeul de control ITCF/TFS şi, dacă acestea sunt absente, atunci se continuă cu godeurile de test. Se determină, în minimum 10 câmpuri microscopice, numărul mediu de celule fluorescente tipice morfologic per câmp şi se calculează populaţia de celule pe mililitru de depozit nediluat (apendice 4). În timpul testului de imunofluorescenţă, pot apărea mai multe probleme. - Populaţii de bacterii saprofite pot indica celule fluorescente atipice morfologic şi pot provoca reacţii încrucişate. Alte bacterii pot părea asemănătoare cu C.m. ssp. sepedonicus ca talie şi morfologie. Se iau în considerare doar celulele fluorescente cu talie şi morfologie tipice. Din cauza posibilităţii producerii unor reacţii încrucişate, probele cu un test de imunofluorescenţă pozitiv trebuie să fie retestate utilizând un antiser diferit. - Limita tehnică de detecţie a acestei metode se situează între 10â şi 10" celule pe ml de depozit nediluat. Probele cu un număr de celule tipice fluorescente la limita detecţiei sunt de obicei libere de C.m. ssp. sepedonicus, dar pot fi supuse testului vinetei. Testul IF este negativ pentru toate probele în care nu s-a găsit nici o celulă fluorescentă cu morfologie tipică. Se consideră că aceste probe sunt "necontaminate" cu C.m. ssp. sepedonicus. Testul vinetei nu este necesar. Testul IF este pozitiv pentru toate probele în care s-au identificat celule fluorescente cu morfologie tipică. Probele la care s-a identificat un test de imunofluorescenţă pozitiv cu ambele antiseruri sunt considerate ca "potenţial contaminate" cu C.m. ssp. sepedonicus. Testul vinetei este necesar pentru toate probele considerate a fi potenţial contaminate. 6. Testul vinetei Pentru detalii de cultură, vezi apendicele 5. 6.1. Depozitul obţinut la punctul 3.3 se inoculează la cel puţin 25 de vinete aflate în stadiu de trei frunze (apendice 5) printr-una din metodele indicate mai jos (punctele 6.2, 6.3 sau 6.4). 6.2. Inoculare prin tăiere I 6.2.1. Se aşează fiecare ghiveci în poziţie orizontală într-o excavaţie făcută pe o placă de polistiren expandat cu dimensiunile de 5 cm x 10 cm x 15 cm (H x l x L) (figura 3); excavaţia de mai sus este adecvată pentru un ghiveci de 10 cm. Între tulpina vinetei şi placa de polistiren expandat se introduce o folie de aluminiu sterilă pentru fiecare mostră testată. Planta este fixată în jurul plăcii cu o bandă de cauciuc. 6.2.2. Cu ajutorul unui bisturiu, se execută între cotiledoane şi prima frunză o tăietură longitudinală sau uşor diagonală de 0,5 până la 1 cm lungime şi cu o adâncime de aproximativ trei pătrimi din diametrul tulpinii. 6.2.3. Se ţine deschisă tăietura cu vârful lamei bisturiului şi cu ajutorul unei pensule fine, înmuiată în inocul, se tamponează pereţii tăieturii. Toate vinetele se inoculează în mod asemănător. Figura 3-------------- NOTĂ(CTCE) Figura 3 - se găseşte în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 654 bis din 16 septembrie 2003 la pagina 30 (a se vedea imaginea asociată). 6.2.4. Se închide tăietura cu vaselină sterilă, folosind o seringă de 2 ml. 6.3. Inoculare prin tăiere II 6.3.1. Se ţine planta între două degete şi se pipetează o picătură (circa 5 până la 10 мl) din inocul pe tulpină, între cotiledoane şi prima frunză. 6.3.2. Utilizând un bisturiu steril, se execută o tăietură în diagonală (într-un unghi de aproximativ 5°), cu o lungime de 1,0 cm şi o adâncime de aproximativ 2/3 din grosimea tulpinii, tăietura începând de la picătura de inocul. 6.3.3. Se închide tăietura cu vaselină sterilă cu ajutorul unei seringi. 6.4. Inoculare prin seringă 6.4.1. Vinetele nu se udă cu o zi înaintea inoculării pentru a reduce turgescenţa. 6.4.2. Se inoculează tulpinile de vânătă exact deasupra cotiledoanelor folosind o seringă cu ac hipodermic (de minimum 23G). Se distribuie inoculul între toate plantele. 6.5. Se inoculează 25 de vinete cu o cultură cunoscută de C.m. ssp. sepedonicus şi, dacă este posibil, cu un ţesut de tubercul infectat (punctul 5.1.) prin aceeaşi metodă de inoculare (punctele 6.2., 6.3. sau 6.4.). 6.6. Se inoculează 25 de vinete cu TFS steril de 0,05 M prin aceeaşi metodă de inoculare (punctele 6.2., 6.3. sau 6.4.). 6.7. Vinetele se incubează în condiţii corespunzătoare (apendice 5) timp de 40 de zile. Se examinează regulat simptomele după opt zile. Se numără vinetele care prezintă simptome. C.m. ssp. sepedonicus cauzează ofilirea frunzelor vinetelor, care poate începe ca o înmuiere marginală sau internervuriană. Ţesutul ofilit poate să aibă iniţial o culoare verde închis sau pestriţă dar care devine mai pală înainte de necrozare. Ofilirile internervuriene au adesea un aspect unsuros apos. Ţesutul necrozat are a deseori o margine galbenă strălucitoare. Vinetele nu mor neapărat; cu cât este mai îndelungată perioada care precede apariţia simptomelor cu atât cresc şansele de supravieţuire. Vinetele pot învinge infecţia. Vinetele ţinere susceptibile sunt mult mai sensibile la populaţiile reduse de C.m. ssp. sepedonicus decât plantele mai bătrâne, de unde necesitatea de a utiliza vinete aflate în stadiu de trei frunze sau exact înaintea acestuia. Ofilirile pot fi provocate de asemenea de populaţii de alte bacterii sau ciuperci prezente în depozitul ţesutului de tubercul. Acestea includ Erwinia carotovora, ssp. carotovora şi E. Carotovora ssp. atroseptica, Phoma exigua var. foveata precum şi de populaţii mari de bacterii saprofite. Aceste ofiliri pot fi deosebite de cele cauzate de C.m. ssp. sepedonicus deoarece toate frunzele sau întreaga vânătă se ofilesc rapid. 6.8. Se prepară o coloraţie Gram (punctul 4) pentru toate loturile de vinete care prezintă simptome, utilizând secţiuni de ţesut de frunză ofilită şi de tulpină de vânătă şi se izolează într-un mediu nutritiv adecvat (punctul 7). Se dezinfectează frunzele şi tulpinile vinetelor prin ştergere cu o soluţie de etanol 70%. 6.9. În anumite cazuri, în special dacă condiţiile de creştere nu sunt optime, este posibil ca C.m. ssp. sepedonicus să existe ca o infecţie latentă în vinete chiar după incubaţia de 40 de zile. Aceste infecţii pot avea ca rezultat piticirea şi pierderea vigorii vinetelor inoculate. Dacă testul IF este considerat pozitiv, se poate considera că este necesară o testare suplimentară. Este esenţial să se compare ratele de creştere ale tuturor plantelor supuse testului vinetei cu controalele inoculate cu TFS steril de 0,05 M şi să se monitorizeze condiţiile de mediu din seră. Recomandările pentru testele ulterioare sunt următoarele: 6.9.1. Se taie tulpinile deasupra locului inoculării şi se îndepărtează frunzele. 6.9.2. Se macerează tulpinile în TFS de 0,05 M şi pH 7,0 ca la punctele 3.1 până la 3.2. 6.9.3. Se utilizează o jumătate de suspensie pentru a efectua o coloraţie Gram (punctul 4) şi un test IF (punctul 5). 6.9.4. Se utilizează cealaltă jumătate pentru un nou test al vinetei (punctul 6), dacă coloraţia Gram şi/sau testele IF sunt pozitive. Se foloseşte o cultură cunoscută C.m. ssp. sepedonicus şi controale sterile de TFS 0,05 M. Dacă nu se observă simptome în testul ulterior, proba este considerată negativă. 7. Izolarea lui C.m. ssp. sepedonicus Diagnosticul poate fi confirmat doar dacă C.m. ssp. sepedonicus este izolat şi identificat ca atare (punctul 8). Deşi C.m. ssp. Sepedonicus este un organism dificil, el poate fi izolat din ţesutul care prezintă simptome. Totuşi el poate fi mascat prin creşterea rapidă de bacterii saprofite şi de aceea, izolarea directă din depozitul de ţesut de tubercul (punctul 3.3.) nu este recomandată. Vinetele asigură un excelent mediu selectiv de îmbogăţire pentru dezvoltarea lui C.m. ssp. sepedonicus şi, de asemenea, un excelent test gazdă de confirmare. Se fac izolări din toţi tuberculii de cartof şi vinete care prezintă simptome (punctele 4, 6). Dacă este necesar, macerarea tulpinilor vinetelor se face ca la punctele 3. şi 6.9. 7.1. Suspensiile se însămânţează în striuri pe unul din următoarele medii (formulele sunt indicate în apendicele 6): nutritiv dextroză-agar (numai pentru subculturi), drojdie-peptonă-glucoză-agar, drojdie-dextroză-agar, drojdie de extract de săruri minerale agar. Se incubează la 21°C timp de 20 de zile. C.m. ssp. sepedonicus creşte încet, producând de obicei colonii cu un vârf ascuţit, cremos, de forma unei cupole, în termen de 10 zile. Pentru stabilirea purităţii, suspensia se reînsămânţează în striuri Ratele de creştere sunt îmbunătăţite prin subculturi. Coloniile tipice sunt de un alb cremos sau ivoriu, rotunde, netede, înălţate, cu formă de cupolă convexă, mucoid fluide, cu margini întregi şi cu un diametru de 1 până la 3 mm. 8. Identificarea Din plantele sănătoase sau bolnave de cartofi şi vinete se pot izola numeroase bacterii corineforme Gram pozitive, cu caractere coloniale similare celor produse de C.m. ssp. sepedonicus. În acest context, C.m. ssp. sepedonicus poate fi identificat prin următoarele teste: Testul IF (punctul 5.1), testul vinetei, testele de nutriţie şi fiziologice (apendice 7), - testul oxidării/fermentării (O/F), - testul oxidazei, - creşterea la 37°C, - producţia de urează, - hidroliza esculinei, - hidroliza amidonului, - toleranţa la o soluţie de clorură de sodiu 7%, - testul indolului, - testul catalazei, - producţia de H(2)S, - utilizarea citratului, - hidroliza gelatinei, - acid din: glicerol, lactoză, ramnoză şi salicină, - coloraţia Gram. Toate testele trebuie să includă un control cunoscut de C.m. ssp. sepedonicus. Testele nutriţionale şi fiziologice se fac utilizând inoculări din subculturile agar. Comparaţiile morfologice se fac din culturi de dextroză agar. Pentru testul IF, populaţiile de celule trebuie să fie ajustate la 10^6 celule/ml. Titrul IF trebuie să fie similar celui al culturii cunoscute de C.m. ssp. sepedonicus. Pentru testul vinetei, populaţiile de celule trebuie să fie ajustate la 10^7 celule/ml. Testele vinetei se fac utilizând zece plante pentru fiecare din organismele testate, utilizând din nou cultura cunoscută de C.m. ssp. sepedonicus şi controale de apă sterilă; în cazul culturilor pure ofilirea se obţine în 20 de zile, dar plantele care nu prezintă simptome după această perioadă trebuie să fie incubate pe o durată totală de 30 de zile, la temperaturi care să determine dezvoltarea vinetelor dar fără să depăşească 30°C (apendicele 5). Dacă după 30 de zile simptomele nu sunt prezente, nu se poate confirma prezenţa lui C.m. ssp. sepedonicus în cultura respectivă.
Testul C.m. ssp. Sepedonicus
O/F Inert sau slab oxidativ
Oxidază -
Catalază +
Reducţia nitraţilor -
Activitatea ureazei -
Producţia de H'S -
Producţia de indol -
Utilizarea citraţilor -
Hidroliza amidonului - sau slab
Creşterea la 37° -
Creşterea în soluţie de NaCl 7% -
Hidroliza gelatinei -
Hidroliza esculinei +
Acid din:
- glicerol -
- lactoză - sau slab
- ramnoză -
- salicină _
Apendicele 1 FORMULA FLUIDULUI DE MACERARE RECOMANDAT DE LELLIOTT ŞI SELLAR, 1976
Compus DC silicon MS A (Hopkins Williams 10 ml
Ltd, Cat. Nr. 9964 - 25, Chadwell Heatch,
Essex, Anglia)
Fulgi de lubrol W (ICI Ltd) 0,5 g
Pirofosfat de tetrasodiu 1 g
Tampon fosfat salin 0,05 M cu pH 7,0 1 litru
(apendicele 2)
Apendicele 2 SOLUŢII TAMPON Tampon fosfat salin 0,05 M cu pH 7,0 Această soluţie tampon poate fi folosită pentru macerarea ţesuturilor de tuberculi (2.1.)
Na(2)HPO(4) 4,26 g
KH(2)PO(4) 2,72 g
NaCl 8,0 g
Apă distilată până la 1 litru
Tampon fosfat salin de 0,01 M cu pH 7,2 Această soluţie tampon este utilizată pentru diluarea antiserurilor şi spălarea lamelelor IF
Na(2)HPO(4) ● 12 H(2)O 2,7 g
NaH(2)PO(4) ● 2 H(2)O 0,4 g
NaCl 8,0 g
Apă distilată până la 1 litru
Glicerină fosfatică tamponată de 0,1 M cu pH 7,6 Această soluţie tampon este utilizată pentru mărirea fluorescenţei în cadrul testului IF
Na(2)HPO(4) ● 12 H(2)O 3,2 g
NaH(2)PO(4) ● 2 H(2)O 0,15 g
Glicerol 50 ml
Apă distilată 100 ml
Apendicele 3 PROCEDEUL COLORĂRII GRAM (MODIFICAREA LUI HUCKER) (DOETSCH, 1981) Soluţie de cristale violete Se dizolvă 2 g de violet cristalin în 20 ml etanol 95%. Se dizolvă 0,8 g oxalat de amoniu în 80 ml apă distilată. Se amestecă soluţiile. Iodul Lugol Iod 1 g Iodură de potasiu 2 g Apă distilată 300 ml Cristalele solide sunt pisate într-un mojar. Se adaugă apă şi se agită până la dizolvare într-un recipient închis. Soluţia de colorare cu safranină Se alcătuieşte soluţia: Safranină O 2,5 g Etanol 95% 100 ml Se amestecă şi se stochează. Se diluează: 1:10 pentru a obţine o soluţie de lucru. Procedeul de colorare 1. Se pregătesc frotiurile şi dispozitivele de uscare şi încălzire cu aer. 2. Se imersează lamela într-o soluţie de violet cristalin timp de un minut. 3. Se spală cu apă de la robinet. 4. Se imersează în iod Lugol timp de un minut. 5. Se spală cu apă de la robinet şi se usucă cu un absorbant. 6. Se decolorează cu etanol 95%, adăugat prin picurare, până când nu se mai decolorează sau se imersează în etanol timp de 30 de secunde, agitând uşor. 7. Se spală cu apă de la robinet şi se usucă cu un absorbant. 8. Se imersează în soluţie de safranină timp de 10 secunde. 9. Se spală cu apă de la robinet şi se usucă cu un absorbant. Coloraţia bacteriilor Gram pozitive este violet-albastră; bacteriile Gram negative au o coloraţie roz-roşie. Apendicele 4 DETERMINAREA POPULAŢIEI DE CELULE POZITIVE LA TESTUL IF
piD²
Aria (S) godeului lamelei multispot = ──── (1)
4
Unde D = diametrul ferestrei.
pid²
Aria (s) câmpului obiectivului = ──── (2)
4
unde d = diametrul crmpului.
Se calculează d prin măsurare directă sau prin formulele următoare:
pi●i²
s = ────── (3)
G²K²x4
unde i = coeficientul crmpului (depinde de tipul ocularului şi variază
de la 8 la 24)
K = coeficientul tubului (1 sau 1,25)
G = puterea de mărire (100 x, 40 x, etc.) a obiectivului
┌─────
din (2), se obţine d = │4s/pi
\│
┌─────────
│ pi●i²
│4x ──────
\ │ G²K²x4 i
din (3), se obţine d = \ │───────── = ── (4)
\│ pi GK
Se numără celulele fluorescente tipice pe câmp (c).
Se calculează numărul celulelor fluorescente tipice pe godeu (C).
S
C = c ● ─
s
Se calculează numărul celulelor fluorescente tipice pe ml de depozit (N).
1000
N = Cx ──── x F
y
unde y = volumul depozitului pe godeu,
unde F = factorul de diluţie a depozitului.
Apendicele 5 CULTURA VINETELOR Se însămânţează seminţe de vânătă (Solanum melongena cv. Black Beauty) într-un compost pasteurizat pentru seminţe. Se plantează plantulele cu cotiledoane complet dezvoltate (10-14 zile) într-un compost pasteurizat pentru ghivece. Se utilizează vinete în stadiu de trei frunze, atunci când cel puţin două dar nu mai mult de trei frunze sunt desfăcute complet. Vinetele trebuie să fie cultivate în seră, în următoarele condiţii: durata zilei: 14 ore de lumină naturală sau mai mult; temperatura: ziua: 21 până la 24°C, noaptea: 15°C. N.B.: C.m. ssp. sepedonicus nu creşte la temperaturi de peste 30°C. Dacă temperaturile nocturne nu scad la 15°C se poate produce deteriorarea cromoforului (necroza argintie). Deteriorarea rădăcinii cauzate de larvele sciaride poate fi evitată prin aplicarea unui insecticid adecvat. Vânăta Black Beauty poate fi obţinută de la firmele următoare: 1. AB Hammenhogs Fro, 50-Hammenhog, Sweden; 2. HURST Seeds Ltd, Avenue Road, Witham, Essex CM8 2DX, England; 3. ASGRO Italia Sp A, Corso Lodi, 23, Milan; 4. KUPPER Mitteldeutsche Samen GmbH, Hessenring 22, D-37269 Eschwege. Apendicele 6 MEDII PENTRU CREŞTEREA ŞI IZOLAREA LUI C.M. SSP. SEPEDONICUS Agar nutritiv (NA) Agar nutritiv difco bacto în apă distilată la standardul producătorului. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute. Dextroză agar (NDA) cu un conţinut de 1% D(+) glucoză (monohidrat). Se sterilizează prin autoclavare la 115°C timp de 20 minute. Drojdie-glucoză-peptonă agar (YPGA)
Extract de drojdie difco bacto (nr. 0127) 5 g
bacto Peptonă difco bacto (nr. 0118) 5 g
D(+) - glucoză (monohidrat) 10 g
Agar purificat difco bacto (nr. 0560) 15 g
Apă distilată 1 litru
Se sterilizează 0,5 l de mediu prin autoclavare la 115°C timp de 20 de minute. Mediu de extract de drojdie de săruri minerale (YGM)
Extract de drojdie difco bacto 2,0 g
D(+) - glucoză (monohidrat) 2,5 g
K(2)HPO(4) 0,25 g
KH(2)PO(4) 0,25 g
MgSO(4) ● 7H(2)O 0,1 g
MnSO(4) ● H(2)O 0,015 g
NaCl 0,05 g
FeSO(4) ● 7H(2)O 0,005 g
Agar purificat difco bacto 18 g
Apă distilată 1 litru
Se sterilizează 0,5 l mediu prin autoclavare la 115°C timp de 20 de minute. Apendicele 7 TESTE NUTRIŢIONALE ŞI FIZIOLOGICE PENTRU IDENTIFICAREA LUI C.M. SSP. SEPEDONICUS Toate mediile trebuie să fie incubate la 21°C şi se examinează după 6 zile. Dacă creşterea nu a avut loc, se incubează până la maximum 20 de zile. - Testul oxidativ şi fermentativ (Hugh şi Leipson, 1953) - testul O/F. Mediul de bază:
KCl 0,2 g
MgSO(4) ● 7H(2)O 0,2 g
NH(4)H(2)PO(4) 1,0 g
Peptonă difco bacto 1,0 g
Agar purificat difco bacto 3,0 g
D(+) - glucoză (monohidrat) 10,0 g
Albastru de bromtimol 0,03 g
Apă distilată 1 litru
Se amestecă şi se ajustează la un pH de 7,0 până la 7,2 cu KOH 1N. Se distribuie câte 5 ml şi 10 ml în eprubeta de cultură Pyrex de 16 mm x 100 mm (capacitate 12 ml). Se sterilizează prin autoclavare la 115°C timp de 10 minute Se inoculează fiecare cultură prin înţepare adâncă în eprubeta de 5 şi 10 ml. În mod antiseptic, se adaugă 1 până la 2 ml parafină lichidă sterilă în eprubeta de 10 ml. Se incubează. Reacţie pozitivă:
┌───────────────────┬───────────────────────────────┬──────────────────────────┐
│ Tub │ Culoare │ Interpretare │
├───────────────────┼───────────────────────────────┼──────────────────────────┤
│Deschis │Galben │Fermentativă │
│Închis │Galben │ │
│ │ │ │
│Deschis │Galben │Oxidativă │
│Închis │Verde-albastru │ │
│ │ │ │
│Deschis │Verzui │Oxidativă sau inertă │
│Închis │Verde-albastru │ │
└───────────────────┴───────────────────────────────┴──────────────────────────┘
- Testul oxidazei (Kovacs, 1956) Reactivul lui Kovacs pentru testul oxidazei: Soluţie apoasă de dihidroclorură de tetrametil parafenilenediamin (BDH nr. 30386) 1% în apă distilată. Acest reactiv trebuie să fie preparat proaspăt în volume de 1 ml sau poate fi conservat într-o sticlă maronie la 5°C timp de 1 până la patru săptămâni. Se pune o picătură de reactiv pe o hârtie de filtru într-un vas Petri curat. Se rade imediat o parte din cultura de testare de pe agarul nutritiv utilizând o ansă de platină. Reacţie pozitivă: Apare o coloraţie purpurie în termen de 10 secunde. Culturile pentru care coloraţia apare într-un timp de 10 până la 30 de secunde sunt slab pozitive. N.B.: Este esenţial să se utilizeze o ansă de platină şi culturi NA deoarece urmele de fier sau conţinutul ridicat de zahăr din mediul de creştere pot da rezultate pozitive false. - Producţia de acid din lactoză, ramnoză, salicină, glicerol. Se prepară un mediu Hugh şi Leifson O/F rară glucoză. Se distribuie câte 5 ml în eprubete. Se sterilizează prin autoclavare la 115°C timp de 10 minute. În procesul de topire, când baza atinge 45°C, se adaugă, în mod aseptic, 0,5 ml de soluţie apoasă 1 0%, sterilizată prin filtrare, fie de glicerol, lactoză, ramnoză sau salicină. Se amestecă cu grijă. Reacţie pozitivă: Schimbarea culorii din verde-albastru în galben indică producerea acidului - Testul catalazei Se pune o picătură de peroxid de hidrogen (30 de volume) pe o lamă curată şi se emulsifiază adăugând conţinutul unei anse de platină de cultură. Reacţie pozitivă: Producerea de bule de oxigen indică prezenţa catalazei. - Reductaza nitratului şi denitrificarea (Bradbury, 1970) Mediu de cultură:
KNO(3) (fără nitrit) 1 g
Extract de drojdie difco bacto 1 g
K(2)HPO(4) 5 g
Apă distilată 1 litru
Se dozează câte 10 ml în sticle de 20 ml. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
Reactiv A:
H(2)SO(4) 8 g
Acid acetic 5N 1 litru
Reactiv B:
Naftilamină 5 g
Acid acetic 5N 1 litru
Se inoculează mediul de nitrat în duplicat. Se testează după 10 şi 20 de zile adăugând o picătură de iod Lugol, 0,5 ml reactiv A şi 0,5 ml reactiv B. Dacă mediul nu devine roşiatic, se adaugă aproximativ 50 mg pudră de zinc. Se observă reacţia culorii.
Reacţia pozitivă: Reacţia culorii
Etapa 1 Etapa 2
Nici o reducere de nitrat incolor roşu
Reducerea nitratului până la nitrit roşu
(numai reductaza nitratului)
Reducerea nitratului peste nitrit incolor incolor
(denitrificare - reductaza nitratului
şi nitritului)
- Producţia de urează (Lelliott, 1966)
Mediu de cultură:
Bază de uree oxoid agar (CM53) 2,4 g
Apă distilată 95 ml
Se sterilizează prin autoclavare la 115°C timp de 20 de minute. Se răceşte baza topită până la 50°C şi se adaugă, în mod antiseptic, 5 ml de soluţie de uree apoasă 40% (oxoid SR20) sterilizată prin filtrare. Se amestecă bine. Se dozează câte 6 ml în eprubete sterile (16x100 mm) şi se lasă să se depună în pantă. Reacţie pozitivă: Mediul galben-portocaliu capătă o coloraţie roşie vişinie sau roz fucsină, dacă s-a produs o urează. Utilizarea citratului (Christensen) (Skerman, 1967)
Bază de titrat agar (Merck 2503) 23 g
Apă distilată 1 litru
Se amestecă şi se dizolvă prin încălzire. Se dozează câte 6 ml, ca pentru mediul testului de producere a ureazei. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 de minute şi se lasă să se depună în pantă. Reacţie pozitivă: Utilizarea citratului este indicată printr-o reacţie de schimbare a culorii mediului din portocaliu în roşu. - Producţia de sulfură de hidrogen (Ramamurthi, 1959) Mediu:
Tripton difco bacto (nr. 0123) 10 g
K(2)HPO(4) 1 g
NaCl 5 g
Apă distilată 1 litru
Se dizolvă şi se dozează câte 6 ml în eprubete de 16x100 mm. Se sterilizează prin autoclavare la 115°C timp de 10 de minute. Se inoculează. La gura eprubetei, în mod aseptic, se pune o hârtie de acetat de plumb (Merck 9511). Se fixează cu capacul. Se incubează timp de maximum douăzeci de zile. Reacţie pozitivă: Producerea H(2)S din tripton este indicată prin colorarea negru maronie a hârtiei reactive. - Producere de indol (Ramamurthi 1959) Mediu: Ca şi pentru testul H(2)S. Se îndepărtează hârtia de acetat de plumb şi se adaugă 1 până la 2 ml de eter dietilic şi se agită uşor. Se lasă la decantat (5 min). Se adaugă 0,5 ml de reactiv Kovacs (Merck 9293) în eprubetă înclinat. Reacţie pozitivă: Prezenţa indolului este indicată prin apariţia unei culori roşii în stratul galben dintre eter şi faza apoasă. - Creştere la 37°C (Ramamurthi, 1959) Mediu:
Amestec nutritiv bacto difco 8 g
NaCl 70 g
Apă distilată 1 litru
Se amestecă, se dizolvă şi se dozează câte 6 ml în eprubete. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 de minute. Se inoculează şi se incubează la 37°C. Reacţie pozitivă: Se urmăreşte creşterea. - Creşterea în clorură de sodiu 7% (Ramamurthi, 1959) Mediu:
Amestec nutritiv difco bacto 8 g
NaCl 70 g
Apă distilată 1 litru
Se amestecă, se dizolvă şi se dozează câte 6 ml în eprubete. Sterilizaţi prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute. Reacţie pozitivă: Se urmăreşte creşterea. - Hidroliza gelatinei (Lelliot, Billing & Hayward, 1966) Mediu:
Gelatină difco bacto (nr. 0143) 120 g
Apă distilată 1 litru
Se amestecă, se dizolvă prin încălzire şi se dozează câte 6 ml în eprubete. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 de minute. Reacţie pozitivă: Lichefierea gelatinei chiar dacă temperatura rămâne de la 5°C timp de 30 de minute. - Hidroliza amidonului Mediu:
Agar nutritiv bacto difco (topit) 1 litru
Amidon solubil bacto difco (nr. 0178) 2 g
Se amestecă şi se sterilizează prin autoclavare la 115°C timp de 10 minute. Se toarnă în vase. Se inoculează vasele în spoturi. Dacă se constată o creştere bună (10 până la 20 de zile), se prelevează o parte din produs şi se imersează în iod Lugol. Reacţie pozitivă: Hidroliza amidonului este indicată prin zone limpezi, sub sau în jurul creşterii bacteriene; restul mediului se colorează în purpuriu. - Hidrolaza esculinei (Sneath & Collins, 1974) Mediu:
Peptonă bacto difco 10 g
Esculină 1 g
Citrat feric (Merck 3862) 0,05 g
Citrat de sodiu 1 g
Apă distilată 1 litru
Se dizolvă prin amestecare şi se dozează câte 6 ml în eprubete. Se sterilizează în autoclavă la 115°C timp de 10 de minute. Mediul este limpede, cu o fluorescentă albăstruie. Reacţie pozitivă: Hidroliza esculinei este indicată prin apariţia unei culori maro şi dispariţia fluorescenţei. Aceasta poate fi controlată utilizând o lampă cu raze ultraviolete. PARTEA B Pentru materialul listat în anexele 2 şi 4 ale Hotărârii Guvernului nr. 1.030/2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România. 1.a) Măsurile oficiale de carantină includ inspecţia adecvată sau testarea pentru organismele dăunătoare relevante listate în Anexele 1 şi 2 ale Hotărârii Guvernului nr. 1030/2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România şi sunt luate în conformitate cu exigenţele specifice menţionate în Anexa 4 a Hotărârii Guvernului nr. 1030/2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România pentru organismele dăunătoare specifice, b) Pentru respectarea exigenţelor specifice, metodele folosite pentru măsurile de carantină sunt cele prevăzute în Anexa 4 a Hotărârii Guvernului nr. 1030/2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România, sau alte măsuri echivalente adecvate aprobate oficial. 2. Materialul trebuie să fie găsit liber, în conformitate cu prevederile paragrafului 1, de organisme dăunătoare relevante specificate în anexele 1, 2 şi 4 ale Hotărârii Guvernului nr. 1030/2001 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România. --------- 
