Cel mai bun serviciu de monitorizare a actelor publicate in Monitorul Oficial
────────
la norma sanitarã veterinara
────────────────────────────
MANUAL
de proceduri de diagnostic, metode de prelevare de probe şi criterii pentru evaluarea rezultatelor testelor de laborator pentru confirmarea şi diagnosticul diferential al bolii veziculoase a porcului
CAP. 1
Introducere, obiective şi definiţii
1. Prezentul manual de proceduri de diagnostic cuprinde metode de prelevare de probe şi criterii pentru evaluarea rezultatelor testelor de laborator pentru confirmarea şi diagnosticul diferential al bolii veziculoase a porcului:
a) principiile de baza şi condiţiile minime privind procedurile de diagnostic, metodele de prelevare de probe şi criteriile pentru evaluarea rezultatelor testelor de laborator pentru un diagnostic corespunzãtor al bolii veziculoase a porcului. O importanta deosebita se acorda diagnosticului diferential cu febra aftoasa;
b) prevederile anexei nr. 2 la Norma sanitarã veterinara privind mãsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi mãsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului şi, în special, pct. 4, 7 şi 8 ale anexei menţionate;
c) informaţii folosite în primul rând de autoritãţile responsabile pentru controlul bolii veziculoase a porcului, accentul fiind pus pe principiile şi aplicatiile testelor de laborator şi pe evaluarea rezultatelor acestora şi nu pe tehnici detaliate de laborator.
2. Conform prezentului manual, se înţelege prin:
a) porc seropozitiv - orice porc al cãrui ser are un titru de anticorpi egal sau mai mare decât serul 4 de referinta al bolii veziculoase a porcului la care se referã cap. X;
b) reactant unic - orice porc singur seropozitiv dintr-o exploatatie, care dezvolta un rezultat pozitiv la teste serologice pentru boala veziculoasa a porcului, dar care nu are antecedente de contact cu virusul bolii veziculoase a porcului şi pentru care nu exista vreo dovada a rãspândirii infectiei la porcii de contact. Un porc seropozitiv este confirmat ca reactant unic dacã sunt îndeplinite condiţiile la care se referã cap. VIII lit. C;
c) porci de contact - porci care au contact direct sau au avut contact direct, în ultimele 28 de zile, cu unul sau mai mulţi porci seropozitivi sau cu unul sau mai mulţi porci suspecti de a fi infectati cu virusul bolii veziculoase a porcului. Porcii de contact pot fi cazati în aceeaşi boxa sau în boxe adiacente, dacã exista posibilitatea contactului porcilor între boxe.
CAP. 2
Principii de baza pentru controlul porcilor care prezintã semne clinice ale bolii veziculoase a porcului
1. Când într-o exploatatie este suspectata prezenta virusului bolii veziculoase a porcului, un numãr statistic semnificativ de porci trebuie sa fie verificat de cãtre medicul veterinar oficial, cat mai curând posibil, pentru a se detecta eventuale semne clinice ale bolii la care se referã prezenta anexa.
2. Când porcii prezintã semne clinice pe baza cãrora se suspicioneaza boala veziculoasa a porcului sau febra aftoasa, este efectuat, cat mai curând posibil, diagnosticul diferential, prin mijloace adecvate de prelevare de probe şi investigaţii de laborator, conform prevederilor cap. IV, VII şi VIII.
CAP. 3
Proceduri generale pentru prelevare şi transport de probe
1. Orice persoana care intra sau iese din exploataţii de porci, atunci când exista o suspiciune de boala veziculoasa a porcului, trebuie sa respecte mãsurile de igiena cele mai stricte, necesare pentru a reduce riscul contaminarii sau rãspândirii cu virus.
2. Toţi porcii de la care au fost prelevate probe trebuie sa fie marcati individual în asa fel încât sa poatã fi identificati pentru eventuale reprelevari de probe. Se recomanda sa fie înregistratã localizarea fiecãrui porc din exploatatie de la care au fost prelevate probe, împreunã cu marca sa individualã de identificare, în special dacã au fost prelevate probe de la porci suspecti.
3. Problele trebuie sa fie trimise la laborator, însoţite de documentele corespunzãtoare, care vor include detalii ale antecedentelor clinice ale porcilor de la care au fost prelevate probe şi semnele clinice observate, dacã exista.
4. Atât timp cat orice afectiune veziculoasa la porci poate fi suspectata ca fiind febra aftoasa, trebuie sa fie luate precautii speciale pentru impachetarea în condiţii de siguranta maxima a probelor suspecte. Aceste precautii se referã la prevenirea spargerii sau fisurarii containerelor, precum şi la riscul contaminarii, fiind, de asemenea, important sa se asigure ca probele sa ajungã la laborator într-o stare satisfãcãtoare. Dacã este pusã gheaţa în interiorul unui astfel de pachet, trebuie sa fie prevenite scurgerile de apa. Nici un container ce conţine probe suspecte de contaminare cu virusul bolii veziculoase a porcului nu trebuie sa fie deschis decât când a ajuns în laborator.
5. Probele suspecte de contaminare cu virusul bolii veziculoase a porcului trebuie sa fie analizate numai într-un laborator autorizat pentru a manipula virusul febrei aftoase în scopul diagnosticului, conform legislaţiei naţionale cu privire la controlul febrei aftoase, chiar dacã suspiciunea de febra aftoasa a fost deja eliminata.
6. Toate probele vor fi transportate la temperatura de 4°C, dacã durata transportului pana la laboratorul de destinaţie este mai mica de 48 ore, sau la o temperatura maxima de -20°C, dacã durata transportului este mai mare.
7. Pentru probe destinate laboratorului de referinta comunitar singura metoda de transport permisã este pe calea aerului via aeroportul din Londra (Heathrow) sau aeroportul Gatwick. Înainte de imbarcarea probelor laboratorul respectiv trebuie sa fie informat prin fax (+44-1483 23 26 21) sau prin e-mail despre detaliile de zbor, data, timpul de sosire prevãzut şi numãrul zborului, pentru ca pachetul sa poatã fi localizat la sosire. Pachetul trebuie sa fie adresat Institutului pentru Sãnãtate Animala, Laboratorul Pirbright, Laboratorul de referinta comunitar pentru boala veziculoasa a porcului, Ash Road, Pirbright, Woking, Surrey GU24 ONF, Regatul Unit al Marii Britanii şi Irlandei de Nord, UK.
Urmãtoarele informaţii trebuie, de asemenea, sa fie incluse pe eticheta: "Material patologic animal fãrã valoare comercialã. Perisabil. Fragil. A fi ridicat din aeroport prin adresa. A nu fi deschis în afarã laboratorului". Ridicarea autorizata a pachetului la aeroport se efectueazã de personalul de la laboratorul de referinta comunitar, în baza unei autorizaţii generale de import special emisã în acest scop de Ministerul Agriculturii, Alimentaţiei şi Pescuitului din Regatul Unit al Marii Britanii şi Irlandei de Nord. Acesta este un acord permanent, o licenta separatã care nu este solicitatã pentru orice import. Transportul ca bagaj de mana al materialului vezicular suspect de cãtre personal neautorizat, în Regatul Unit al Marii Britanii şi Irlandei de Nord, precum şi prin companiile de curierat este interzis.
8. Transportul probelor la laboratoarele naţionale trebuie sa fie conform instrucţiunilor stabilite de autoritatea veterinara centrala a României.
CAP. 4
Proceduri de prelevare a probelor într-o exploatatie cu porci suspecti clinic
1. Când într-o exploatatie este suspectata prezenta virusului bolii veziculoase a porcului şi au fost observate semne clinice de boala, trebuie sa fie prelevate probe corespunzãtoare de la grupuri reprezentative de porci care prezintã aceste semne, pentru a se confirma boala şi a se efectua diagnosticul diferential fata de febra aftoasa.
2. În aceste exploataţii probele de referinta pentru diagnostic sunt epiteliul şi lichidul vezicular recoltat de la vezicule proaspãt rupte sau nerupte şi prelevate de la porci care prezintã semne tipice de boala şi la care pot fi detectate virusul bolii veziculoase a porcului, antigenele sau genomul acestora. Se recomanda sa fie prelevate probe de la 5 sau 6 asemenea porci.
3. Chiar dacã sunt disponibile tesut epitelial proaspãt şi lichid vezicular în cantitate suficienta (1 g sau mai mult), trebuie sa fie prelevate şi urmãtoarele probe:
a) probe de sânge de la porci suspecti şi porcii de contact, pentru testare serologica;
b) probe de fecale de la porci suspecti, de pe podeaua boxei acestora şi de la boxele adiacente, pentru testare virusologica.
4. Probele trebuie sa fie prelevate şi transportate conform urmãtoarelor proceduri:
a) pentru probe epiteliale şi lichid vezicular:
1. trebuie sa fie prelevat, dacã este posibil, cel puţin 1 g de tesut epitelial de la o vezicula rupta recent sau una nerupta. Se recomanda ca porcii sa fie sedati înainte ca probele sa fie prelevate, pentru a se evita vãtãmarea personalului şi din motive de bunastare a porcilor;
2. dacã transportul probelor cãtre laboratorul naţional este efectuat imediat - în mai puţin de 3 ore -, probele epiteliale pot fi transportate uscate şi pãstrate refrigerate. Dacã durata transportului depãşeşte 3 ore, probele trebuie sa fie puse într-un mediu de transport de volum mic, care consta din cantitãţi egale de glicerol şi 0,04 M fosfat-tampon sau alte substanţe-tampon echivalente, astfel încât pH-ul sa fie menţinut în limita optima pentru supravietuirea virusului febrei aftoase (pH de la 7,2 la 7,6). Mediul de transport trebuie sa conţinã antibiotice pentru activitate suplimentarã antimicrobiana. Antibioticele corespunzãtoare şi concentratiile acestora per ml, definitive, sunt: 1.000 U.I. penicilina, 100 U.I. neomicina sulfat, 50 U.I. polimixina B sulfat, 100 U.I. micostatin;
3. dacã poate fi prelevat lichid vezicular de la o vezicula nerupta, acesta trebuie sa fie pãstrat nediluat, într-un container separat;
b) pentru probe de sânge: pot fi prelevate probe de sânge pentru teste serologice sau virusologice. În general, acestea sunt prelevate pentru detectarea anticorpilor şi doar de la porci suspecti de a se fi insanatosit de infectia clinica sau subclinica, în timp ce epiteliul, lichidul vezicular şi probele de fecale de la porci care prezintã semne clinice de boala sunt mult mai adecvate pentru detectarea virusului decât probele de sânge. Se recomanda ca probele de sânge integral sa fie prelevate folosindu-se seringi vacuumate fãrã anticoagulant, iar acestea trebuie sa fie transportate fãrã a fi deschise;
c) pentru probe de fecale:
1. probe de fecale recoltate de pe podeaua clãdirilor suspectate de a conţine sau de a fi conţinut porci infectati cu virusul bolii veziculoase a porcului sau tampoane fecale şi probe de fecale de la porci în viata suspecti trebuie sa fie plasate în containere solide şi rezistente la scurgeri;
2. containerele cu probe suspecte trebuie sa fie dezinfectate pe dinafara, înainte de a fi transportate la laborator. Dezinfectantii corespunzatori sunt:
(i) hidroxidul de sodiu (dilutie 1:100);
(ii) formolul (dilutie 1:9 de soluţie de formol care conţine minimum 34% formaldehida); şi
(iii) hipocloritul de sodiu (cu 2% clor disponibil).
Aceşti dezinfectanti trebuie sa fie manevrati cu grija, deoarece sunt caustici.
CAP. 5
Proceduri de prelevare a probelor pentru supravegherea serologica a bolii veziculoase a porcului
1. Pentru supravegherea exploataţiilor, atunci când nu exista nici o evidenta sau o suspiciune ca boala poate fi prezenta, se efectueazã prin prelevare de probe serologice de rutina.
2. Pentru supravegherea la abator, la piata, la un centru de colectare sau în locuri similare, se efectueazã prin prelevare de probe serologice de rutina.
3. Pentru supravegherea nediscriminatorie a porcilor primiţi din state membre ale Uniunii Europene, probele de sânge pentru testarea serologica trebuie sa fie prelevate de la porci din exploatatiile în care au fost introdusi, conform prevederilor legale în vigoare.
4. Pentru supravegherea exploataţiilor situate în cadrul zonelor de protecţie sau de supraveghere care au fost stabilite ca urmare a confirmãrii focarelor de boala, conform pct. 7 şi 8 din anexa nr. 2 la Norma sanitarã veterinara privind mãsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi mãsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului, sau pentru supravegherea exploataţiilor la care se referã art. 9 din Norma sanitarã veterinara privind mãsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi mãsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului, probele de sânge trebuie sa fie prelevate de la porci, pentru testare serologica, conform cu urmãtoarea schema:
a) în cazul exploataţiilor pentru reproducţie trebuie sa fie efectuatã o procedura aleatorie de prelevare de probe, în asa fel încât sa se detecteze o prevalenta de 5% de seroconversie cu 95% fidelitate;
b) în cazul exploataţiilor care conţin numai porci pentru ingrasare, procedura de prelevare de probe trebuie sa asigure ca numãrul total de probe prelevate sa fie cel puţin egal cu numãrul necesar pentru a se detecta o prevalenta de 5% de seroconversie cu 95% fidelitate. În orice caz probele trebuie sa fie prelevate, pe cat este posibil, de la cat mai multe boxe selectate aleatoriu;
c) în cazul exploataţiilor mixte, de creştere şi reproducţie, trebuie sa fie prelevate probe de la fiecare grup de porci care este cazat în clãdiri separate, în asa fel încât sa se detecteze o prevalenta de 5% de seroconversie cu 95% fidelitate.
CAP. 6
Acţiuni ulterioare şi proceduri de reprelevare de probe în cazul detectarii de porci seropozitivi
1. Când într-o exploatatie este detectat un singur porc seropozitiv în urma supravegherii la care se referã cap. V pct. 1 sau 4, autoritatea veterinara localã trebuie:
a) sa aplice mãsurile la care se referã art. 4 din Norma sanitarã veterinara privind mãsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi mãsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului;
b) sa efectueze un control în exploatatie conform prevederilor cap. II pct. 1;
c) sa preleveze probe de sânge pentru testarea serologica de la:
- porcul suspect;
- porcii de contact care sunt cazati în aceeaşi boxa sau în boxe adiacente cu porcul suspect. Trebuie sa fie prelevate probe de la aceşti porci în asa fel încât sa se detecteze o prevalenta de 50% de seroconversie cu 95% fidelitate pentru fiecare boxa.
2. Autoritatea veterinara centrala a României poate decide sa ridice mãsurile la care se referã pct. 1 lit. a) al prezentului capitol, dacã:
a) ancheta epizootologica efectuatã conform prevederilor art. 8 din Norma sanitarã veterinara privind mãsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi mãsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului arata ca boala veziculoasa a porcului nu a fost introdusã în exploatatie;
b) nici un semn clinic de boala veziculoasa a porcului nu a fost detectat în exploatatie; şi
c) exploatatia nu este situata într-o zona de supraveghere sau de restrictie, stabilitã ca urmare a unui focar de boala confirmat, nu este supusã altor restrictii aplicate cu privire la un focar de boala confirmat şi cu condiţia ca:
- nici un porc din exploatatie sa nu facã obiectul comerţului României cu statele membre ale Uniunii Europene; şi
- porci de la exploatatia respectiva sa fie livrati doar la un abator pentru a fi taiati imediat sau la alta exploatatie din care nici un porc nu face obiectul comerţului României cu statele membre ale Uniunii Europene, pana când rezultatele controalelor ulterioare şi ale testelor serologice arata ca boala veziculoasa a porcului poate fi eliminata definitiv.
3. Dacã controalele şi testele serologice efectuate conform pct. 1 lit. b) şi c) ale prezentului capitol:
a) au rezultate negative sau numai un porc pozitiv este în prealabil confirmat pozitiv (reactant unic), boala veziculoasa a porcului poate fi infirmata. Mãsurile la care se referã pct. 1 lit. a) vor fi ridicate, cu excepţia cazului când exploatatia se afla într-o zona de protecţie sau de supraveghere stabilitã în jurul unui focar de boala, unde mãsurile de eradicare a bolii trebuie sa fie în vigoare, conform pct. 7 sau 8 din anexa nr. 2 la Norma sanitarã veterinara privind mãsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi mãsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului;
b) arata faptul ca este prezent mai mult de un porc seropozitiv în exploatatie, boala veziculoasa a porcului trebuie sa fie confirmatã sau, dacã condiţiile stabilite la pct. 4 din anexa nr. 2 la Norma sanitarã veterinara privind mãsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi mãsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului nu sunt îndeplinite pentru a confirma prezenta acestei boli, trebuie sa fie prelevate din exploatatie ulterior probe conform procedurilor de prelevare de probe la care se referã pct. 4 al prezentului capitol.
4. În cazul în care este detectat mai mult de un porc seropozitiv într-o exploatatie, ca urmare a prelevarii de probe şi a testelor serologice la care se referã cap. V pct. 1 şi 3 sau pct. 2 al prezentei anexe, iar condiţiile stabilite la pct. 4 din anexa nr. 2 la Norma sanitarã veterinara privind mãsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi mãsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului nu sunt îndeplinite, pentru a se confirma boala veziculoasa a porcului autoritatea veterinara centrala a României trebuie sa dispunã urmãtoarele:
a) aplicarea sau continuarea aplicãrii prevederilor art. 4 din Norma sanitarã veterinara privind mãsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi mãsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului;
b) efectuarea unui control în acea exploatatie, conform prevederilor cap. II pct. 1;
c) prelevarea ulterior de probe de sânge pentru testarea serologica de la porci seropozitivi şi de la porcii de contact, conform pct. 1 lit. c) al prezentului capitol;
d) prelevarea probelor de sânge pentru testarea serologica de la porcii din alte clãdiri ale exploatatiei, conform procedurii cap. V pct. 2;
e) prelevarea unui numãr suficient de probe de fecale pentru testele virusologice:
(i) de la porci seropozitivi;
(ii) de pe podeaua boxelor care conţin porci seropozitivi şi a boxelor adiacente;
(iii) din boxe selectate aleatoriu din alte clãdiri ale exploatatiei - probele de fecale prelevate trebuie sa fie examinate cat mai curând posibil, conform prevederilor pct. (i) şi (ii).
Dacã aceste probe sunt negative, dar rezultatele testelor serologice creeazã suspiciunea ca virusul bolii veziculoase a porcului poate fi rãspândit la celelalte clãdiri, trebuie prelevate probe de fecale conform prevederilor pct. (iii), pentru a fi examinate; dacã în urma acestor controale şi teste ulterioare condiţiile stabilite la pct. 4 din anexa nr. 2 la Norma sanitarã veterinara privind mãsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi mãsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului nu sunt îndeplinite, pentru a se confirma prezenta bolii veziculoase a porcului, porcii seropozitivi vor fi ucisi sau taiati, conform prevederilor pct. 4 lit. d) din anexa nr. 2 la Norma sanitarã veterinara privind mãsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi mãsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului. Dacã ulterior au fost gasiti mai mulţi porci seropozitivi, pe lângã ceilalţi deja gasiti seropozitivi ca urmare a prelevarii de probe anticipate, prevederile şi procedurile stabilite la lit. a), b), c), d) şi e) ale prezentului punct vor fi aplicate ulterior mutatis mutandis.
5. Fãrã a aduce atingere mãsurilor prevãzute la art. 9 din Norma sanitarã veterinara privind mãsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi mãsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului, când unul sau mai mulţi porci sunt detectati pozitiv, ca urmare a activitãţii de supraveghere la care se referã cap. V pct. 2 sau 3, autoritatea veterinara centrala a României va dispune:
a) efectuarea controalelor ulterioare corespunzãtoare, când este necesar, care includ şi prelevarea de probe, pentru a se confirma sau a se infirma boala veziculoasa a porcului în locul unde aceşti porci au fost detectati, luând în considerare situaţia epizootologica localã;
b) aplicarea în exploatatia de origine a acestor porci a mãsurilor prevãzute la art. 4 din Norma sanitarã veterinara privind mãsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi mãsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului;
c) efectuarea unui control în exploatatia de origine a acestor porci, conform prevederilor cap. II pct. 1; şi
d) prelevarea probelor de sânge de la porcii din exploatatia de origine pentru testarea serologica a porcilor seropozitivi, conform prevederilor cap. V pct. 2.
6. Autoritatea veterinara centrala a României poate decide sa ridice mãsurile prevãzute la pct. 5 lit. b) al prezentului capitol, dacã:
a) ancheta epizootologica, efectuatã conform prevederilor art. 4 şi 8 din Norma sanitarã veterinara privind mãsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi mãsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului, arata ca boala veziculoasa a porcului nu a fost introdusã în exploatatie;
b) nici un semn clinic de boala veziculoasa a porcului nu a fost detectat în exploatatie;
c) exploatatia nu este situata într-o zona de supraveghere sau de restrictie stabilitã ca urmare a confirmãrii unui focar de boala şi nu este supusã altor restrictii aplicate pentru a se confirma un focar de boala, cu condiţia ca:
(i) nici un porc din exploatatie sa nu facã obiectul comerţului României cu statele membre ale Uniunii Europene; şi
(ii) porcii din exploatatie sa fie destinaţi doar tãierii imediate, la un abator sau la alta exploatatie de la care nici un porc nu face obiectul comerţului României cu statele membre ale Uniunii Europene, pana când rezultatele controalelor ulterioare şi ale testelor serologice efectuate în locul unde au fost detectati porci seropozitivi şi în exploatatia de origine arata ca boala veziculoasa a porcului poate fi cu certitudine infirmata.
CAP. 7
Principii şi aplicaţii ale testelor virusologice şi evaluarea rezultatelor lor
A. Detectarea antigenului viral
1. Un test sandwich ELISA indirect înlocuieşte testul de fixare a complementului, ca metoda selectata pentru detectarea antigenului viral al bolii veziculoase a porcului. Testul este acelaşi ca cel utilizat pentru diagnosticul febrei aftoase. Testele pentru cele doua boli trebuie sa fie efectuate în acelaşi timp, cu excepţia cazului în care febra aftoasa a fost deja infirmata. Se recomanda în special probe de epiteliu sau de lichid din leziunile veziculoase, în care atât virusul bolii veziculoase a porcului, cat şi cel al febrei aftoase pot fi prezente la titruri înalte la porcii cu infectie acuta şi care sunt detectati în câteva ore*1).
──────────────
*1) Rezultatele pozitive ELISA sunt asociate cu prezenta a cel puţin 10 5 TCID50 - doze infectioase de cultura de tesut - de virus în probe.
Randuri duplicat din plãcile ELISA multigodeu sunt acoperite cu antiser de iepure contra virusului bolii veziculoase a porcului şi pentru fiecare dintre cele 7 serotipuri ale virusului febrei aftoase. Acestea sunt seruri de blocare. Suspensii ale probei de testat se adauga la fiecare godeu al celor doua randuri. Controale pozitive sunt de asemenea incluse. Ser de detectie omolog de cobai este adãugat în godeurile din randurile respective, în etapa urmãtoare ori apoi, de ser de iepure anticobai conjugat cu o enzima, cum ar fi peroxidaza de hrean. Se realizeazã spalarea intensiva între fiecare etapa, pentru a se îndepãrta reagentii nelegati.
O reactie pozitiva este indicatã dacã exista o reactie de culoare la adãugarea cromogenului şi a substratului. Reactiile intens pozitive pot fi evidentiate cu ochiul liber, dar rezultate pot sa fie citite, de asemenea, spectrofotometric, caz în care o citire a absorbantei de 0,1 deasupra limitei de fond indica o reactie pozitiva.
2. Pot fi folosite sisteme alternative bazate pe anticorpi monoclonali, sisteme care selecteaza anticorpi monoclonali precum anticorpii de blocare şi anticorpii peroxidazo-conjugati monoclonali ca anticorpi de detectie, pentru detectarea antigenului bolii veziculoase a porcului şi pentru diagnosticul diferential de febra aftoasa în probele de epiteliu, lichid vezicular sau cultura de tesut infectat.
3. Poate fi folosit un sistem bazat pe anticorpi monoclonali pentru a se studia variatia antigenica dintre tulpinile virusului bolii veziculoase a porcului. Antigenele virale crescute în tesutul-cultura sunt blocate de un antiser hiperimun de iepure contra bolii veziculoase a porcului, adsorbit de faza solida. Secvente corespunzãtoare de anticorpi monoclonali reactioneaza şi legarea anticorpilor monoclonali la tulpinile sãlbatice este comparata cu legarea anticorpilor monoclonali la tulpinile parentale. O legatura similarã indica prezenta epitopilor, impartiti între tulpinile parentale şi cele sãlbatice.
B. Izolarea şi creşterea virusului
1. Ca rutina, suspensii filtrate de probe de epiteliu, lichid vezicular sau fecale suspecte de a conţine virusul bolii veziculoase a porcului trebuie sa fie inoculate pe culturi de celule sensibile. Dacã cantitatea şi calitatea probelor prelevate din leziuni şi supuse examinãrii sunt insuficiente pentru examinarea imediata prin ELISA, este necesarã creşterea de virus în cultura de tesut pentru a amplifica antigenul viral.
2. Pentru a izola şi a creste virusul, suspensia epiteliala filtrata este inoculata pe culturi monostrat de celule IB-RS-2. Trebuie sa fie utilizate doua dilutii de suspensie epiteliala, una de concentraţie mare (1/500) şi una de concentraţie mica (1/10) pentru a evita interferenta cu virusul crescut pe interferon, a cãrui eliberare va interfera cu virusul bolii veziculoase a porcului. Pentru izolarea virusului sunt adãugate numai antibiotice, în vederea menţinerii mediului. Pentru diagnosticul diferential fata de febra aftoasa trebuie, de asemenea, sa fie inoculate celule tiroidiene primare de bovine sau celule renale de pui de hamster (BHK-21).
3. Dacã se dezvolta un efect citopatic, fluidul supernatant trebuie sa fie prelevat din culturile pozitive, atunci când efectul este complet, şi utilizat în testul ELISA pentru identificarea virusului. Culturile negative trebuie sa fie inoculate pe culturi de tesut proaspãt de 48 sau 72 de ore, iar acest pasaj orb trebuie examinat dupã 72 de ore. În absenta efectului citopatic, dupã un pasaj orb ulterior proba poate fi declarata negativa pentru prezenta virusului viu.
4. Suspensii de probe de fecale pot fi procesate ca în descrierea de la pct. 1. Deoarece în general exista mai puţin virus în fecale decât în epiteliu, este esenţial ca în absenta unui efect citopatic la primele doua pasaje sa fie inclus un al treilea pasaj orb.
5. Inocularea simultanã a unei linii celulare porcine şi a unuia dintre sistemele de cultura de tesut menţionat mai sus - de preferat celule tiroidiene bovine primare - este un ghid util pentru a determina dacã probele veziculare conţin virusul bolii veziculoase a porcului sau virusul febrei aftoase care, ca şi în primul sistem, se va dezvolta numai în celule de origine porcina. Totuşi culturile de virus al febrei aftoase, cu o istorie îndelungatã de transmitere între porci, pot, de asemenea, sa se dezvolte, de preferinta, în sistemele de culturi celulare de origine porcina.
C. Reactia de polimerizare în lant pentru depistarea genomului (PCR)
1. Metode de recunoaştere a acidului nucleic pot fi utilizate pentru a detecta genomul viral al bolii veziculoase a porcului în materialul clinic şi care foloseşte tehnica PCR pentru a stabili legãturile dintre tulpinile de virus al bolii veziculoase a porcului, prin determinarea secventei de nucleotide a unei pãrţi de genom. Tehnici care folosesc PCR au fost perfectate pentru a se îmbunãtãţi sensibilitatea diagnosticului. Au fost descrise proceduri de PCR-RT uşor diferite, folosind primeri care corespund unor regiuni intens conservate din genele 1C şi 1D ale genomului viral.
2. Tehnica PCR este rapida - rezultatele sunt de obicei disponibile în 24 de ore - şi se detecteaza toate genotipurile de virus al bolii veziculoase a porcului, fiind suficient de sensibila pentru a se utiliza la prelevarea probelor de la cazurile suspecte clinic de boala.
3. Atunci când este suspectata infectia subclinica sau atunci când probele sunt colectate dupã disparitia bolii clinice ori când este necesarã procesarea probelor de fecale, tehnicile PCR-RT perfectionate, asemãnãtoare PCR-RT secventiale, PCR-imun, PCR-ELISA şi metode mai elaborate de extracţie a ARN, care produc un sistem de detectare cel puţin la fel de sensibil, dar considerabil mult mai rapid decât pasajul multiplu pe cultura de tesut.
4. Prin secventarea a aproximativ 200 de nucleotide din cadrul genei 1D care codifica proteina structuralã majorã VP1 este posibila gruparea tulpinilor virusului bolii veziculoase a porcului, conform omologiei lor de secventa, precum şi a tulpinilor înrudite epidemiologic şi care provoacã boli în regiuni diferite sau la perioade diferite.
D. Evaluarea rezultatelor testelor virusologice
1. Detectarea de antigene sau de genom al virusului bolii veziculoase a porcului prin metodele ELISA sau PCR are aceeaşi valoare de diagnostic ca şi izolarea virusului.
2. Totuşi izolarea virusului trebuie sa fie consideratã ca test de referinta şi trebuie sa fie utilizata ca test de confirmare, dacã este necesar, în special dacã un rezultat pozitiv ELISA sau PCR nu este asociat cu:
a) detectarea de semne clinice ale bolii;
b) detectarea de porci seropozitivi; sau
c) o legatura epizootologica directa cu un focar confirmat.
CAP. 8
Principii şi aplicaţii ale testelor serologice şi evaluarea rezultatelor acestora
A. Test de neutralizare a virusului (VN)
1. Microtestul cantitativ de virus neutralizare (VN) pentru detectarea anticorpilor indusi de virusul bolii veziculoase a porcului este efectuat pe celule IB-RS-2 sau pe un sistem de celule echivalent, în plãci de microtitrare cu fundul lat din categoria cu cultura de tesut.
2. Virusul este crescut în monostraturi de celule IB-RS-2 şi depozitat fie la -20°C dupã adãugarea de glycerol 50%, fie la -70°C fãrã glycerol. Serurile sunt inactivate înaintea testarii la 56°C timp de 30 de minute.
B. ELISA
1. Testul ELISA pentru detectarea anticorpilor este un test competitiv bazat pe anticorpi monoclonali. Dacã proba de ser conţine anticorpi ai virusului bolii veziculoase a porcului, legatura unor anticorpi monoclonali selectaţi, conjugati cu peroxidaza, cu antigenul virusului bolii veziculoase a porcului va fi inhibata. În acest test ELISA antigenul viral al bolii veziculoase a porcului este blocat în faza solida, folosindu-se anticorpi monoclonali, apoi probele de ser sunt incubate în dilutie corespunzãtoare, urmatã de adãugarea anticorpului monoclonal conjugat cu peroxidaza. Ulterior inhibitia legãturii anticorpului monoclonal cu antigenul bolii veziculoase a porcului este masurata prin intermediul unui substrat şi al unui cromogen.
2. Un test ELISA indirect de blocare, care foloseşte anticorpi monoclonali izotipi specifici pentru a se detecta IgG sau IgM specifica porcului contra virusului bolii veziculoase a porcului, este util pentru evaluarea timpului de la infectia porcilor sau de la contaminarea spaţiilor infectate. În cazul acestui test ELISA izotipul specific antigenului viral este blocat în faza solida, folosindu-se un anticorp de captare a antigenului. Dacã proba de ser conţine anticorpi pentru virusul bolii veziculoase a porcului, aceştia sunt detectati folosindu-se o IgG antiporc sau o IgM antiporc monoclonal conjugat cu peroxidaza. Ulterior aceasta legatura este masurata prin intermediul unui substrat şi al unui cromogen.
Testul ELISA izotip specific poate fi util, de asemenea, pentru deosebirea reactantului unic de adevaratii porci pozitivi, asa cum prevede lit. C.
C. Aplicarea testelor serologice şi evaluarea rezultatelor
1. Testul de VN şi testul ELISA sunt teste serologice recomandate. Cap. X enumera serurile de referinta care sunt disponibile la laboratorul de referinta comunitar, pentru a standardiza testele serologice efectuate în Comunitatea Europeanã. Testul de VN trebuie sa fie considerat ca test de referinta, dar are dezavantajul ca se finalizeazã în 2 sau 3 zile şi necesita facilitãţi pentru culturi celulare. Testul ELISA este mult mai rapid şi poate fi mult mai uşor standardizat. Testul ELISA de competiţie cu anticorpi monoclonali este cel mai fiabil. Testul ELISA descris pana în prezent, utilizând anticorpi ai bolii veziculoase a porcului, este recomandat ca test de screening pentru un numãr mare de probe. Totuşi testul de VN trebuie sa fie utilizat ca test de confirmare, dacã este necesar, în special dupã prima detectare de probe pozitive într-o exploatatie. Porcii pozitivi la testul ELISA, dar negativi la testul de VN, pot fi omisi.
2. Prezenta unui reactant unic*2) poate fi suspectata atunci când este detectat un singur porc seropozitiv şi când sunt îndeplinite urmãtoarele criterii:
a) nu exista semne clinice de boala în exploatatie;
b) nu exista un istoric relevant al bolii clinice în exploatatie;
c) nu exista antecedente de contact cu un focar de boala.
3. Un porc este confirmat drept reactant unic atunci când:
a) dupã testare nu sunt identificati alţi porci seropozitivi;
b) prelevarea de probe efectuatã la porcii de contact dupã prima detectare a reactantului unic nu indica seroconversie;
c) titrul de anticorpi pentru o prelevare de probe repetatã rãmâne constant sau deviaza.
4. Totuşi urmãtoarele criterii şi principii suplimentare trebuie, de asemenea, sa fie luate în considerare pentru confirmarea unui reactant unic:
a) reactantii unici apar cu o prevalenta de aproximativ 1 per 1.000 de porci;
b) serurile de la reactantii unici au, în general, urmãtorul profil: titrul anticorpilor scãzut la testul de VN, linia de granita pozitiva la testul ELISA de competiţie pe baza de anticorpi monoclonali, nici o IgM şi nici o IgG la testul ELISA izotip specific pentru boala veziculoasa a porcului*3).
CAP. 9
Semne clinice şi particularitãţi ale bolii veziculoase a porcului
1. Boala veziculoasa a porcului este o boala contagioasa a porcilor, produsã de un enterovirus din familia Picornaviridae care poate evolua sub forma veziculoasa subclinica, uşoarã sau severã, ce depinde de tulpina de virus implicata, de calea şi doza infectanta, precum şi de condiţiile de creştere în care au fost ţinuţi porcii. Factorii de stres suplimentari, precum transportul, aglomerarea cu alţi porci şi temperaturile extreme, pot, de asemenea, predispune la dezvoltarea semnelor clinice.
2. Boala se caracterizeazã printr-o febra uşoarã şi apariţia de vezicule pe bureletul coronarian, pe protuberantele calcaielor, pe pielea membrelor şi mai puţin frecvent pe rat, buze, limba şi mameloane. Rata morbiditatii poate fi pana la 100%, iar mortalitatea este foarte scãzutã sau nulã.
3. Infectia se poate dezvolta sub o forma inaparenta sau uşoarã care prezintã doar o afectare tranzitorie în starea generalã a porcilor şi care conduce la dezvoltarea de anticorpi ce neutralizeaza virusul în câteva zile*4). Din cauza naturii subclinice sau uşoare a bolii, aceasta este deseori suspectata prima, ca urmare a testelor serologice pentru supravegherea bolii sau pentru certificarea exportului. Focarele europene recente de boala veziculoasa a porcului au fost caracterizate prin semne clinice mai puţin severe sau chiar fãrã semne clinice, diagnosticul fiind frecvent dependent de testele serologice. Totuşi semnele clinice ale bolii veziculoase a porcului nu se pot deosebi de cele ale febrei aftoase. Orice forma veziculara trebuie sa fie tratata iniţial ca suspecta de febra aftoasa, iar diagnosticul diferential trebuie sa fie efectuat cat mai curând posibil.
──────────────
*2) O proporţie mica de reactant unic poate fi detectata prin orice test serologic curent utilizat pentru boala veziculoasa a porcului. Factorii responsabili pentru reactantii unici sunt necunoscuţi.
Reactivitate serologica incrucisata cu virusul bolii veziculoase a porcului poate aparea datoritã infectarii cu un alt picornavirus încã neidentificat sau poate fi datorat altor factori nespecifici prezenţi în ser.
*3) IgG specifica singura sau atât IgG, cat şi IgM sunt de obicei detectate în probe de ser de la porcii infectati cu virusul bolii veziculoase a porcului, întrucât serul de la reactantii unici conţine în general numai IgM. IgG nu va fi detectata în probele de ser de la porcii infectati cu virusul bolii veziculoase a porcului într-o perioada de pana la 10 sau 14 zile. Totuşi IgG specifica va fi detectata în a doua proba de sânge. Porcii infectati recent nu pot fi deosebiţi în mod sigur de reactantii unici înainte ca rãspunsul imun al acestora sa se modifice de la producerea de IgM la cea de IgG. A se vedea, de asemenea, şi nota de subsol*4).
4. Perioada de incubatie a bolii veziculoase a porcului la porcii individuali este, de obicei, între 2 şi 7 zile, dupã care urmeazã febra pasagera de pana la 41°C, dar semnele clinice pot deveni evidente în exploatatie dupã o perioada mai lungã. Veziculele se dezvolta apoi pe bureletul coronarian, în special la jonctiunea cu onglonul. Acestea pot afecta întregul burelet coronarian şi provoacã pierderea copitei. Mult mai rar veziculele pot, de asemenea, sa apara pe rat, în special pe suprafata dorsala, pe buze, pe limba şi pe mameloane, iar eroziuni de dimensiuni mici pot fi observate pe genunchi. Porcii afectaţi pot schiopata şi pot refuza hrana. Porcii mai tineri sunt mult mai sever afectaţi, deşi mortalitatea datoratã bolii veziculoase a porcului este foarte rara, în contrast cu febra aftoasa, la efectivul tânãr.
5. Au fost raportate semne nervoase, dar acestea sunt neobisnuite. Avortul nu este o caracteristica tipica a bolii veziculoase a porcului. Insuficienta cardiaca datoratã miocarditei multifocale poate fi o caracteristica a febrei aftoase şi a encefalomiocarditei, în special la purceii tineri, dar nu apare în boala veziculoasa a porcului.
6. Vindecarea este de obicei completa în 2 sau 3 sãptãmâni, singura evidenta a infectiei fiind o linie orizontala, întunecatã pe copita, acolo unde creşterea onglonului a fost întreruptã temporar.
7. Porcii afectaţi pot excreta virusul prin orificiile nazale şi pe gura şi prin fecale, cu 48 de ore înainte de apariţia semnelor clinice. Cea mai mare cantitate de virus este eliminata în primele 7 zile dupã infectie, iar excretia de virus prin orificiile nazale şi pe gura se opreşte, în mod normal, dupã doua sãptãmâni. Virusul poate fi izolat din fecale pana la 20 de zile dupã infectie, deşi a fost raportatã prezenta sa pana la 3 luni. Acesta poate persista pentru o perioada considerabila în tesutul necrotic asociat cu vezicule rupte şi în fecale.
CAP. 10
Seruri de referinta pentru boala veziculoasa a porcului
──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
Ser de referinta Origine Comentarii*5)
──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
1 Ser normal de porc Ser*5) de control negativ
──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
2 Ser colectat la 21 de zile dupã Ser de control intens pozitiv
infectie (dpi) de la porci infectati
cu tulpina virusului bolii veziculoase
a porcului UKG 27/72
──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
3 Dilutie A 1:10 în NPS a unui ser Un ser slab pozitiv prelevat de la
colectat dupã 5 dpi de la un porc un porc imediat dupã infectie cu o
infectat cu tulpina bolii veziculoase tulpina de virus europeanã recenta
a porcului 8/94/Italia a bolii veziculoase a porcului.
Serul a fost diluat pentru a da un
rezultat slab pozitiv la
testul ELISA şi la testul de VN
──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
4 Dilutie de A 1:40 a unui ser colectat Un ser slab pozitiv care defineste
la 21 dpi de la un porc infectat cu nivelul cel mai scãzut de anticorpi
tulpina virusului bolii veziculoase pe care laboratoarele naţionale
a porcului UKG 27/72 de referinta ale Uniunii Europene
ar trebui sa îl evidentieze ca
fiind consistent pozitiv prin
metoda ELISA şi prin metoda de
neutralizare a virusului.
Echivalent pentru ser RS 01-04-94*6)
──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
5 Ser colectat la 4 dpi de la un Un ser slab pozitiv prelevat de la
porc infectat cu tulpina un porc imediat dupã infectie
virusului bolii veziculoase
a porcului UKG 27/72
──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
6 Ser colectat la 5 dpi de la un Un ser slab pozitiv prelevat de la
porc infectat cu tulpina un porc imediat dupã infectie
virusului bolii veziculoase
a porcului UKG 27/72
──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
──────────
*4) IgM specifica poate fi, de obicei, detectata în sânge de la 2 la 3 zile dupã infectie şi dispare dupã 30 pana la 50 de zile. IgG specifica poate fi, de obicei, detectata în sânge de la 10 la 14 zile dupã infectie şi persista cel puţin pentru cativa ani. Ig izotip poate fi determinata prin intermediul testului ELISA descris la cap. VIII lit. B pct. 2.
*5) Comentarii cu privire la testarea porcilor individuali. Pentru supravegherea serologica sensibilitatea testului folosit trebuie sa fie luatã în considerare.
*6) De exemplu, un ser cu un titru suficient mai crescut decât limita la care acesta este evaluat ca fiind întotdeauna pozitiv prin metoda ELISA şi prin testul de VN la testarea repetatã.
──────────────────
