Comunica experienta
MonitorulJuridic.ro
ART. 1 Analizele pentru controlul oficial al furajelor cu privire la conţinutul acestora de aflatoxinã B(1) trebuie efectuate în conformitate cu metodele descrise în anexa la prezenta normã sanitarã veterinarã. ART. 2 Autoritatea Naţionalã Sanitarã Veterinarã şi pentru Siguranţa Alimentelor informeazã Comisia Europeanã cu privire la actele normative şi prevederile administrative necesare pentru implementarea prezentei norme sanitare veterinare. ANEXĂ ------la norma sanitarã veterinarã---------------------------- DETERMINAREA AFLATOXINEI B(1) A. Metodã cromatograficã monodimensionalã în strat subţire 1. Domeniu şi scop Metoda se utilizeazã pentru determinarea nivelului de aflatoxinã B(1) din materii prime şi furaje simple. Metoda poate fi aplicatã numai dacã în conţinutul acestora nu se gãseşte pulpã de citrice. Limita inferioarã a determinãrii este 0,01 mg/kg (10 ppb). În prezenţa substanţelor interferente, este necesarã repetarea analizei utilizându-se metoda B (metoda cromatograficã de înaltã performanţã în fazã lichidã). 2. Principiul metodei Proba se supune extracţiei cu cloroform. Extractul se filtreazã şi o porţiune alicotã este preluatã şi purificatã pe coloana cromatograficã cu silicagel. Eluatul se evaporã şi reziduul se redizolvã într-un volum specific de cloroform sau într-un amestec de benzen şi acetonitril. O porţiune alicotã din aceastã soluţie se analizeazã prin cromatografie în strat subţire (CSS). Cantitatea de aflatoxinã B(1) se determinã, sub iradierea cu UV a cromatogramei, fie vizual, fie prin fluorodensitometrie, fie prin comparare cu cantitãţi cunoscute de aflatoxinã standard B(1). Identitatea aflatoxinei B(1) extrasã din furaj trebuie sã fie confirmatã prin procedura indicatã. 3. Reactivi NB: Toţi reactivii trebuie sã fie de calitate "pentru analitizã" numai în cazul în care nu s-a stabilit altfel. 3.1. Acetonã 3.2. Cloroform, stabilizat cu 0,5 pânã la 1,0% etanol 96% (v/v) 3.3. n-hexan 3.4. Metanol 3.5. Eter dietilic anhidru, fãrã peroxizi 3.6. Amestec de benzen şi acetonitril: 98/2(v/v) 3.7. Amestec de cloroform (pct. 3.2) şi metanol (pct. 3.4) 97/3(v/v) 3.8. Silicagel, pentru coloana cromatograficã, mãrimea granulei 0,05 pânã la 0,20 mm 3.9. Vatã de bumbac absorbantã, degresatã anterior cu cloroform, sau vatã de sticlã 3.10. Sulfat de sodiu, anhidru, granule 3.11. Gaz inert, de exemplu azot 3.12. Acid clorhidric 1 N 3.13. Acid sulfuric 50%(v/v) 3.14. Diatomit (hyflosupercel), spãlat în acid 3.15. Silicagel G-HR sau echivalent, pentru CSS 3.16. Soluţie standard cu aproximativ 0,1 æg aflatoxinã B(1) per ml preparatã în cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (pct. 3.6), preparat şi verificat aşa cum s-a indicat la secţiunea 7. 3.17. Soluţie standard pentru scopuri de testare calitativã ce conţine aproximativ 0,1 g aflatoxinã B(1) şi B(2) per ml în cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (pct. 3.6). Aceste concentraţii sunt prezentate ca un ghid. Acestea trebuie sã fie ajustate astfel încât sã se obţinã aceeaşi intensitate de fluorescenţã pentru ambele aflatoxine. 3.18. Solvenţi de developare: 3.18.1. Cloroform (pct. 3.2)/acetonã (pct. 3.1): 9/1(v/v), soluţie-mamã nesaturatã; 3.18.2. Eter dietilic (pct. 3.5)/metanol (pct. 3.4)/apã: 96/3/1(v/v/v), soluţie-mamã nesaturatã; 3.18.3. Eter dietilic (pct. 3.5)/metanol (pct. 3/4)/apã: 94/4,5/1,5(v/v/v), soluţie-mamã saturatã; 3.18.4. Cloroform (pct. 3.2)/metanol (pct. 3.4): 94/6(v/v), soluţie-mamã saturatã; 3.18.5. Cloroform (pct. 3.2)/metanol (pct. 3.4): 97/3(v/v), soluţie-mamã saturatã; 4. Aparaturã 4.1. Râşniţã-mixer 4.2. Aparat de agitat sau agitator magnetic 4.3. Hârtie de filtru cutatã, Schleicher şi Schull nr. 588 sau echivalent, diametru: 24 cm. 4.4. Tub de sticlã pentru cromatografie (diametru intern: 22 mm, lungime: 300 mm), cu un robinet PTFE şi un rezervor de 250 ml 4.5. Rotovapor, prevãzut cu un balon cu fund rotund de 500 ml 4.6. Balon conic de 500 ml, cu buşon rodat de sticlã 4.7. Aparaturã pentru CSS 4.8. Plãci de sticlã pentru CSS, 200 x 200 mm, preparate dupã cum urmeazã (cantitãţile indicate sunt suficiente pentru a acoperi cinci plãci): se pun 30 g silicagel G-HR (3.15) într-un balon conic; se adaugã 60 ml apã, se astupã şi se agitã timp de un minut. Se împrãştie suspensia pe plãci astfel încât sã se obţinã un strat uniform de grosime 0,25 mm; se lasã sã se usuce la aer şi apoi se depoziteazã într-un exicator ce conţine silicagel. În momentul utilizãrii, se activeazã plãcile prin ţinerea acestora în cuptor la 110°C timp de o orã. 4.9. Lampã UV cu lungime de undã lungã (360 nm). Intensitatea iradierii trebuie sã facã posibilã, pentru un spot de 1 ng de aflatoxinã B(1), distingerea cu claritate pe o placã CSS la o distanţã de 10 cm de lampã. 4.10. Eprubete gradate de 10 ml cu dopuri de polietilenã 4.11. Spectrofotometru UV 4.12. Fluorodensitometru (opţional) 5. Procedurã 5.1. Prepararea probei (vezi "Observaţii", partea C, pct. 1). Se macinã proba astfel încât întreaga cantitate sã treacã printr-o sitã cu ochiuri de 1 mm (în conformitate cu recomandarea ISO R 565). 5.2. Extracţie Se pun 50 g de probã mãcinatã, omogenizatã într-un tub conic de 500 ml. Se adaugã 25 g de diatomit (3.14), 25 ml de apã şi 250 ml de cloroform (pct. 3.2). Se astupã balonul, se agitã timp de 30 de minute cu aparatul (4.2) şi se filtreazã printr-o hârtie de filtru cutatã (pct. 4.3). Se înlãturã primii 10 ml din filtrat şi apoi se colecteazã 50 ml. 5.3. Curãţarea coloanei Se introduce în capãtul inferior al unui tub de cromatografie (pct. 4.4) un dop de vatã de bumbac sau de sticlã (pct. 3.9), se umplu douã treimi din tub cu cloroform (pct. 3.2) şi se adaugã 5 g de sulfat de sodiu (pct. 3.10). Se verificã dacã suprafaţa superioarã a stratului de sulfat de sodiu este netedã, apoi se adaugtã 10 g de silicagel (pct. 3.8) în porţiuni mici. Se agitã cu atenţie dupã fiecare adãugare, pentru a elimina bulele de aer. Se lasã în repaus timp de 15 minute şi apoi se adaugã cu atenţie 15 g de sulfat de sodiu (pct. 3.10). Se lasã lichidul sã curgã pânã când acesta ajunge deasupra suprafeţei superioare a stratului de sulfat de sodiu. Se amestecã 50 ml de extract colectat (pct. 5.2) cu 100 ml de n-hexan (pct. 3.3) şi se transferã cantitativ amestecul pe coloanã. Se lasã lichidul sã curgã pânã când acesta este exact deasupra suprafeţei superioare a stratului de sulfat de sodiu. Lichidul colectat se eliminã. Apoi se adaugã 100 ml de eter dietilic (pct. 3.5) şi se lasã din nou sã curgã pânã la suprafaţa superioarã a stratului de sulfat de sodiu. În timpul acestor operaţiuni debitul trebuie sã fie de 8 pânã la 12 ml per minut şi coloana nu trebuie sã se usuce. Se eliminã lichidul care curge. Se elueazã apoi cu 150 ml amestec de cloroform/metanol (pct. 3.7) şi se colecteazã întregul eluat. Acesta se evaporã pânã aproape de uscare la o temperaturã ce nu depãşeşte 50°C şi sub un jet de gaz inert (pct. 3.11) cu rotovapor (pct. 4.5). Se transferã cantitativ reziduul, utilizându-se cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen-acetonitril (pct. 3.6), într-o eprubetã gradatã de 10 ml (pct. 4.10). Se concentreazã soluţia sub un jet de gaz inert (pct. 3.11) şi apoi se ajusteazã volumul pânã la 2 ml cu cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (pct. 3.6). 5.4. Cromatografia în strat subţire Pe placa cromatograficã (pct. 4.8) se aplicã spoturi, la 2 cm de la marginea inferioarã, la intervale de 2 cm, cu volumele indicate mai jos din soluţia standard şi din extract: a) 10, 15, 20, 30 şi 40 æl din soluţia standard de aflatoxinã B(1) (pct. 3.16); b) 10 æl din extractul obţinut la pct. 5.3 şi, suprapunându-se pe acelaşi punct, 20 æl de soluţie standard (3.16); c) 10 şi 20 æl de extras obţinut la pct. 5.3. Se developeazã cromatograma la întuneric folosind unul din solvenţii de developare (pct. 3.18). Alegerea solventului trebuie sã fie efectuatã în prealabil, prin depozitarea a 25 æl de soluţie standard calitativã (pct. 3.17) pe placã. Atunci când se developeazã cromatograma la întuneric, aflatoxinele B(1) şi B(2) trebuie sã fie complet separate. Solvenţii se lasã sã se evapore la întuneric, dupã care placa cromatograficã plasatã la 10 cm de lampã (pct. 4.9) se iradiazã cu UV. Spoturile de aflatoxinã B(1) dau o fluorescenţã albastrã. 5.5. Determinãri cantitative Se determinã fie vizual, fie prin fluorodensitometrie, aşa cum este indicat mai jos. 5.5.1. Mãsurãtori vizuale Se determinã cantitatea de aflatoxinã B(1) din extract, prin compararea intensitãţii fluorescenţei din spoturile de extract cu cea a unuia din spoturile soluţiei standard. Dacã este necesar, se interpoleazã. Fluorescenţa obţinutã prin suprapunerea extractului din soluţia standard trebuie sã fie mai intensã decât cea a cantitãţii de 10 æl de extract şi trebuie sã fie mai micã decât un spot vizibil. Dacã intensitatea fluorescenţei datã de cantitatea de 10 æl de extras este mai mare decât cea de 40 æl din soluţia standard, se dilueazã extractul de 10 sau 100 de ori cu cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (pct. 3.6) înainte sã fie supus din nou cromatografiei în strat subţire. 5.5.2. Mãsurãtori prin fluorodensitometrie Intensitatea fluorescenţei spoturilor de aflatoxinã B(1) se mãsoarã cu fluorodensitometru (pct. 4.12), la o excitaţie cu lungime de undã de 365 nm şi o emisie cu lungime de undã de 443 nm. Cantitatea de aflatoxinã B(1) din spoturile de extract se determinã prin compararea intensitãţilor fluorescenţei acestora cu cea a spoturilor de aflatoxinã B(1) standard. 5.6. Confirmarea identitãţii aflatoxinei B(1) Confirmarea identitãţii aflatoxinei B(1) din extract se efectueazã prin procesele indicate mai jos. 5.6.1. Tratare cu acid sulfuric Se pulverizeazã acid sulfuric (pct. 3.13) pe cromatograma obţinutã la pct. 5.4. Fluorescenţa spoturilor de aflatoxinã B(1) trebuie sã se schimbe, sub iradierea UV, din albastrã în galbenã. 5.6.2. Cromatografie bidimensionalã implicând formarea de aflatoxinã B(1) -hemiacetat (aflatoxinã B(2a)) NB: Operaţiunile descrise mai jos trebuie sã fie efectuate urmând cu atenţie diagrama din figura 3. 5.6.2.1. Aplicarea soluţiilor Pentru a preveni migrarea fronturilor solventului se traseazã pe o placã (pct. 4.8) douã linii drepte paralele la douã pãrţi marginale (6 cm de fiecare parte). Se marcheazã soluţiile urmãtoare pe placã utilizându-se pipete capilare sau microseringi: - în punctul A: un volum al probei de extract purificat, obţinutã la pct. 5.3, conţinând aproximativ 2,5 nm aflatoxinã B(1); - în punctele B şi C: 25 æl de soluţie standard (pct. 3.16). 5.6.2.2. Developare Se developeazã cromatograma în direcţia I, la întuneric, utilizând solvent de developare (pct. 3.18.1) (un strat de 1 cm dintr-o soluţie-mamã nesaturatã) pânã când frontul de solvent atinge linia limitã a solventului. Se îndepãrteazã soluţia-mamã de pe placã şi se lasã sã se usuce la întuneric, la temperatura ambiantã, timp de 5 minute. Se pulverizeazã apoi cu acid clorhidric (pct. 3.12) de-a lungul unei benzi de 2,5 cm înãlţime, ce acoperã punctele A şi B (indicatã prin zona haşuratã în figura 3) pânã se înnegreşte, protejând restul plãcii cu o foaie de sticlã. Se lasã sã reacţioneze timp de 10 minute la întuneric şi se usucã cu un curent de aer la temperaturã ambiantã. Se developeazã apoi cromatograma în direcţia II, la întuneric, utilizând solvent de developare (pct. 3.18.1) (un strat de 1 cm dintr-o soluţie-mamã nesaturatã) pânã când frontul de solvent ajunge la linia limitã a solventului. Se îndepãrteazã soluţia-mamã de pe placã şi se lasã sã se usuce la temperatura ambiantã. 5.6.2.3. Interpretarea cromatogramei Se examineazã cromatograma sub luminã UV (pct. 4.9) şi se verificã urmãtoarele caracteristici: a) apariţia unui spot albastru de aflatoxinã B(1) ce provine de la soluţia standard aplicatã în punctul C (migrare în direcţia I); b) apariţia unui spot fluorescent albastru de aflatoxinã B(1) (nu reacţioneazã cu acid clorhidric) şi un spot fluores-cent albastru mai intens de aflatoxinã B(1) -hemiacetat, ambele originare din soluţia standard aplicatã în punctul B (migrarea în direcţia II); c) apariţia de spoturi asemãnãtoare celor descrise la lit. b) ce provin din extractul din proba aplicatã în punctul A. Poziţia acestor spoturi este definitã mai întâi prin distanţa de migrare a aflatoxinei B(1) de la punctul A în direcţia I (aceeaşi ca aceea lucratã prin standardul aplicat la C) şi apoi prin distanţele de migrare de acolo în direcţia II a aflatoxinei B(1) -hemiacetat (aceeaşi ca acelea lucrate prin standardul aplicat la B). Intensitãţile fluorescenţei spoturilor hemiacetate ce provin din extract şi din standardul aplicat în punctul B trebuie sã se potriveascã. 6. Calcularea rezultatelor 6.1. De la mãsurãtorile vizuale Conţinutul în micrograme de aflatoxinã B(1) per kg de probã (ppb) se determinã utilizând urmãtoarea formulã:
m x X
în care: Y şi X = volumele în microlitri ale soluţiei standard de aflatoxinã B(1) (pct. 3.16) şi ale extractului având o intensitate a fluorescenţei similarã; C = concentraţia în micrograme de aflatoxinã B(1) per ml în soluţia standard (pct. 3.16); V = volumul final al extractului în microlitri, permiţând orice diluţie ce a fost necesarã; m = masa în grame a probei corespondente volumului din extractul supus la curãţarea coloanei. 6.2. De la mãsurãtorile fluorodensitometrice Conţinutul în micrograme de aflatoxinã B(1) per kg de probã se determinã utilizând urmãtoarea formulã:
m x Y
în care: Y = volumul în microlitri de extract depus pe placã (10 sau 20 l); C = cantitatea în nanograme de aflatoxinã B(1) din spotul de extras (proporţional valorii Y luate), dedusã din mãsurãtori; V = volumul final al extractului în microlitri, permiţând orice diluţie ce a fost necesarã; m = masa în grame a probei corespondente volumului din extractul supus la curãţarea coloanei. 7. Prepararea şi testarea soluţiei standard (pct. 3.16) 7.1. Determinarea concentraţiei de aflatoxinã B(1) Se preparã o soluţie standard de aflatoxinã B(1) în cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (pct. 3.6) cu o concentraţie de 8 la 10 æg/ml. Se determinã spectrul de absorbţie între lungimile de undã de 330 şi 370 nm cu ajutorul spectrofotometrului (pct. 4.11). Se mãsoarã densitatea opticã (A) la lungimea de undã de 363 nm, în cazul soluţiei de cloroform, sau la lungimea de undã de 348 nm, în cazul soluţiei de amestec de benzen/acetonitril. Pentru soluţia de cloroform, concentraţia în micrograme de aflatoxinã B(1)/ml de soluţie se calculeazã utilizând formula:
20.600
Pentru soluţia formatã din amestecul benzen/acetonitril, concentraţia în micrograme de aflatoxinã B(1) /ml de soluţie se calculeazã utilizând formula:
19.800
Se dilueazã dupã cum este corespunzãtor, ferit de lumina zilei, pentru a obţine o soluţie de lucru standard, cu o concentraţie de aflatoxinã B(1) de aproximativ 0,1 æg/ml. Aceastã soluţie este stabilã timp de douã sãptãmâni dacã se pãstreazã într-un refrigerator la 4°C. 7.2. Testarea puritãţii cromatografice Se depun pe o placã (pct. 4.8) 5 æl soluţie standard de aflatoxinã B(1) ce conţine 8 pânã la 10 æg/ml (pct. 7.1). Se developeazã cromatograma aşa cum s-a indicat la pct. 5.4. În lumina UV cromatograma trebuie sã indice numai un spot şi nu trebuie sã fie perceptibilã în zona de depozitare originalã nicio fluorescenţã. 8. Repetabilitate Diferenţa dintre rezultatele a douã determinãri paralele, efectuate pe aceeaşi probã, prin aceeaşi analizã, trebuie sã fie de maximum: - 25%, corelatã cu rezultatul cel mai mare pentru un conţinut de aflatoxinã B(1) de la 10 şi pânã la 20 æg/kg; - 5 æg, în valoare absolutã, pentru un conţinut mai mare de 20 şi pânã la 50 æg/kg; - 10%, corelatã cu valoarea cea mai mare pentru un conţinut mai mare de 50 æg/kg. 9. Reproductibilitate A se vedea "Observaţii", partea C, pct. 2. B. Metoda cromatograficã de înaltã performanţã în fazã lichidã (HPLC) 1. Domeniu şi scop Metoda se utilizeazã pentru determinarea nivelului de aflatoxinã B(1) din furaje, incluzându-le şi pe cele care conţin pulpã de citrice. Limita inferioarã a determinãrii este 0,001 mg/kg (1ppb). 2. Principiu Proba se supune extracţiei de cloroform. Extractul se filtreazã şi o parte alicotã se purificã printr-un cartuş de florisil şi apoi printr-un cartuş C(18). Separarea finalã şi determinarea sunt realizate cu ajutorul metodei cromatografice de înaltã performanţã în faza lichidã (HPLC), utilizând faza inversã cu coloanã C(18), urmatã de derivatizare postcoloanã cu iod în apã şi detectare fluorescentã. Deoarece micotoxinele sunt substanţe extrem de toxice, manipularea trebuie sã fie efectuatã într-un spaţiu cu abur şi trebuie luate precauţii speciale în cazul în care toxinele sunt în formã uscatã datoritã caracterului electrostatic al acestora şi tendinţei de a se dispersa în mediul de lucru. 3. Reactivi 3.1. Cloroform, stabilizat cu etanol 0,5 pânã la 1%, din masã. A se vedea observaţia pct. 10.2; 3.2. Metanol pentru HPLC; 3.3. Acetonã; 3.4. Acetonitril pentru HPLC; 3.5. Solvenţi pentru eluare: se preparã cu o zi înainte sau îndepãrtaţi ultrasonic aerul din solvenţi. 3.5.1. Amestec de acetonã (pct. 3.3) şi apã, 98 + 2(v + v). 3.5.2. Amestec de apã şi metanol (pct. 3.2), 80+20(v+v). 3.5.3. Amestec de apã şi acetonã (pct. 3.3), 85+15(v+v). 3.6. Faza mobilã pentru HPLC Amestec de apã, metanol (pct. 3.2) şi acetonitril (pct. 3.4), 130+70+40(v+v+v). NB: Compoziţia solventului pentru faza mobilã poate avea nevoie sã fie ajustatã în funcţie de coloana HPLC folositã. 3.7. Soluţie de iod saturatã: se adaugã 2 g la 400 ml apã. Se amestecã cel puţin 90 min. şi se filtreazã printr-o membranã filtrantã (pct. 4.15). Se protejeazã de luminã pentru a preveni fotodegradarea. 3.8. Celit 545 spãlat în acid sau echivalent 3.9. Cartuş de florisil (ape SEP-PAK) sau echivalent 3.10. Cartuş C(18)(ape SEP-PAK) sau echivalent 3.11. Gaz inert, de exemplu azot 3.12. Aflatoxinã B(1) soluţie standard în cloroform, concentraţie 10 æg/ml. Se verificã concentraţia soluţiei, dupã cum urmeazã: se determinã spectrumul de absorbţie a soluţiei între 330 şi 370 nm cu ajutorul spectrofotometrului (pct. 4.23). Se mãsoarã absorbanţa (A) la un maxim aproape de 363 nm. Se calculeazã concentraţia de aflatoxinã B(1) în micrograme per mililitru de soluţie, utilizând formula:
22.300
3.12.1. Aflatoxinã B(1) soluţie pastã standard în cloroform Se transferã cantitativ 2,5 ml aflatoxinã B(1) soluţie standard (pct. 3.12) într-un balon cotat de 50 ml şi se aduce la semn cu cloroform (pct. 3.1). Se depoziteazã soluţia într-un loc rãcoros (4°C), întunecat, bine sigilat şi învelit în folie de aluminiu. 3.13. Aflatoxinã B(1) soluţii de calibrare HPLC NB: Pentru pregãtirea soluţiilor se foloseşte sticlã spãlatã cu acid (a se vedea pct. 4, Aparaturã). 3.13.1. Soluţie calibrare 4 ng/ml Se lasã balonul cotat cu soluţie standard (pct. 3.12.1) în folia de aluminiu sã se încãlzeascã la temperatura camerei (câteva ore). Se transferã cei 400 æl soluţie pastã standard (200 ng aflatoxinã B1) într-un balon cotat de 50 ml şi se evaporã pânã la uscare într-un curent de gaz inert (pct. 3.11). Se dizolvã reziduul obţinut în aproximativ 20 ml amestec apã/acetonã (pct. 3.5.3.), se adaugã amestec apã/acetonã pânã la semn şi se amestecã bine. 3.13.2. Soluţie pentru calibrare 3 ng/ml Se transferã cantitativ 7,5 ml soluţie de calibrare (pct. 3.13.1) într-un balon cotat de 10 ml, se completeazã pânã la semn cu amestec apã/acetonã (pct. 3.5.3) şi se amestecã bine. 3.13.3. Soluţie pentru calibrare 2 ng/ml Se transferã cantitativ 25 ml soluţie de calibrare (pct. 3.13.1) într-un balon volumetric de 50 ml, se completeazã pânã la semn cu amestec apã/acetonã (pct. 3.5.3) şi se amestecã bine. Aceastã soluţie este, de asemenea, indicatã ca standard de referinţã, pentru a fi utilizatã în cazul injectãrilor repetitive în timpul HPLC (pct. 5.5). 3.13.4. Soluţie pentru calibrare 1 ng/ml Se transferã cantitativ 2,5 ml soluţie de calibrare (pct. 3.13.1) într-un balon volumetric de 10 ml, se completeazã pânã la semn cu amestec apã/acetonã (pct. 3.5.3) şi se omogenizeazã. 3.14. Fiolã conţinând amestec de aflatoxine B1, B2, G1 şi G2 cu concentraţia aproximativã de 1, 0,5, 1 şi, respectiv, 0,5 æg/ml în 1 ml cloroform 3.14.1 Soluţie pentru test cromatografic Se transferã conţinutul fiolei (pct. 3.14) într-un flacon cu opritor din sticlã sau cu capac cu filet. Se transferã 40 æl soluţie în tubul de test cu opritor din sticlã (clãtit cu acid) (pct. 4.22). Se evaporã cloroformul în curent de gaz inert (3.11) şi se dizolvã din nou în 10 ml amestec apã/acetonã (pct. 3.5.3). 3.15. Reactivi pentru testul de confirmare (6) 3.15.1. Soluţie saturatã de clorurã de sodiu 3.15.2. Sulfat de sodiu, anhidru, granulat 4. Aparaturã Atenţie! Utilizarea sticlei fãrã a fi spãlatã cu acid pentru soluţii apoase de aflatoxinã poate cauza pierderi. Trebuie sã fie acordatã atenţie deosebitã obiectelor din sticlã noi şi celor de unicã folosinţã, precum şi flacoanelor autoprelevatoare şi pipetelor Pasteur. Obiectele de laborator din sticlã ce au intrat în contact cu soluţii apoase de aflatoxinã trebuie sã fie lãsate câteva ore în acid slab (de exemplu acid sulfuric = 2 mol/l), iar apoi trebuie sã fie clãtite cu apã distilatã, pentru a se îndepãrta toate urmele de acid (de exemplu de trei ori, verificare cu hârtie pH). În practicã, acest tratament este necesar pentru baloanele cu fund rotund (pct. 4.4), baloane cotate, cilindri de mãsurare, flacoane sau tuburi folosite pentru soluţii de calibrare şi extracte finale (în special flacoane pentru autoprelevare) şi pipete Pasteur, dacã acestea sunt folosite pentru transferul soluţiilor de calibrare sau al extractelor. 4.1. Râşniţã-mixer 4.2. Sitã cu orificii de 1,0 mm, (ISO R 565) 4.3. Agitator mecanic 4.4. Evaporator rotativ în vacuum, echipat cu balon cu fund rotund de 150 pânã la 250 ml 4.5. Injector pentru cromatografie cu lichid de înaltã performanţã cu deschidere potrivitã pentru injecţia a 250 ml. A se urmãri instrucţiunile producãtorului pentru umplerea parţialã sau completã a deschiderii. 4.6. Coloanã de analizã HPLC: pachet C(18) 3 æm sau 5 æm 4.7. Pompã fãrã pulsaţie pentru reactiv post-coloanã de iod 4.8. Piesã în formã de T pentru volume moarte zero, inox (1/16" x 0,75 mm) 4.9. Bobinã spiralatã de reacţie; teflon sau inox. Dimensiunile de 3000 x 0,5 mm pânã la 5000x0,5 mm sunt cele mai potrivite în combinaţie cu coloane HPLC de 5 æm sau 3 æm. 4.10. Baie de apã controlatã termostatic, ajustatã la 60°C, cu posibilitate de reglare a temperaturii mai bunã de 0,1°C 4.11. Detector de fluorescenţã, cu excitaţia la lungime de undã 365 nm şi emisia la 435 nm. (Pentru instrument de filtrare: lungimea de undã a emisiei > 400 nm). Trebuie sã fie posibilã detectarea a cel puţin 0,05 ng aflatoxinã B(1) . Unele presiuni pot fi recomandate (de exemplu, reductor, bobinã din teflon sau inox conectatã la borna de ieşire a detectorului), pentru a suprima bulele de aer din celula de flux. 4.12. Dispozitiv de înregistrare 4.13. Integrator electronic (opţional) 4.14. Hârtie filtru cutatã cu diametrul de 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4 sau echivalent 4.15. Membranã filtrantã cu dimensiunea porilor de 0,45 æm, Millipore HAWP 04700 sau echivalent 4.16. Balon conic de 500 ml cu opritor din sticlã 4.17. Coloanã din sticlã (diametru interior de aproximativ 1 cm, lungime de aproximativ 30 cm) echipat cu vârf Luer 4.18. Robinet de închidere Luer rezistent la cloroform (de exemplu, Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514 sau echivalent) 4.19. Seringã rezistentã chimic, racord Luer de 10 ml 4.20. Seringã potrivitã pentru injecţie HPLC de 250 æl (a se vedea pct. 4.5) 4.21. Microseringã de 100 æl pentru prepararea soluţiilor de calibrare (se verificã prin cântãrire ca precizia sã fie de aproximativ 2%) 4.22. Tuburi calibrate de 10 ml cu opritor din sticlã 4.23. Spectrofotometru, potrivit pentru mãsurãtori în regiunea spectralã UV 4.24. Echipament pentru testul de confirmare (6) 4.24.1. Pâlnie pentru separare de 100 æl cu robinet de închidere din teflon, spãlatã cu acid 4.24.2. Bloc pentru încãlzire, 40 pânã la 50°C 5. Procedurã 5.1. Prepararea probei Se macinã proba pânã ce trece prin sitã (pct. 4.2). 5.2. Porţia pentru test Se cântãresc 50 g din proba preparatã în balonul conic (pct. 4.16). 5.3. Extracţie Se adaugã la porţia pentru test 25 g celit (pct. 3.8), 250 ml cloroform (pct. 3.1) şi 25 ml apã. Se astupã balonul şi se agitã 30 de minute cu un agitator mecanic (pct. 4.3). Se filtreazã prin hârtie filtru cu caneluri (pct. 4.14). Se colecteazã 50 ml filtrat. Este necesarã prelevarea unei alicote din filtrat şi diluarea pânã la 50 ml cu cloroform, astfel încât concentraţia de aflatoxinã B(1) sã nu fie mai mare de 4 ng/ml. 5.4. Curãţare: Procedura trebuie sã fie efectuatã fãrã întreruperi semnificative. Atenţie! - laboratorul în care sunt fãcute analizele trebuie protejat adecvat de lumina zilei prin utilizare de: (i) folie absorbantã UV pe ferestre în combinaţie cu luminã slabã (fãrã raze solare); (ii) perdele sau jaluzele în combinaţie cu luminã artificialã (tuburile fluorescente sunt acceptate); - soluţiile ce conţin aflatoxinã trebuie protejate de luminã şi este indicat a se pãstra la întuneric utilizându-se folie de aluminiu. 5.4.1. Purificare Florisil SEP-PAK 5.4.1.1. Pregãtirea ansamblului coloanã-cartuş Se monteazã un robinet de închidere (pct. 4.18) la tija scurtã a cartuşului de florisil (pct. 3.9) (a se vedea figura 1). Se spalã cartuşul şi se eliminã aerul luând 10 ml cloroform (pct. 3.1) şi trecând repede 8 ml prin robinetul de închidere în cartuş, utilizând o seringã (pct. 4.19). Se monteazã tija lungã a cartuşului la coloana din sticlã (pct. 4.17) şi se trec cei 2 ml cloroform rãmaşi prin cartuş în coloanã. Se închide robinetul. Se extrage seringa. 5.4.1.2. Purificare Se adaugã filtratul colectat la pct. 5.3 la ansamblul coloanã-cartuş şi se lasã sã se scurgã. Se spalã cu 5 ml cloroform (pct. 3.1), apoi cu 20 ml metanol (pct. 3.2). Se îndepãrteazã eluatul. În timpul acestor operaţiuni, se asigurã faptul cã ansamblul coloanã-cartuş nu se usucã. Se elueazã aflatoxinã B(1) cu 40 ml amestec acetonã-apã (pct. 3.5.1) şi se colecteazã întregul eluat în balonul cu fundul rotund al evaporatorului rotativ (pct. 4.4). Se concentreazã eluatul pe evaporatorul rotativ la 40°C pânã la 50°C pânã ce nu se mai distileazã acetona. (NB: În acest punct rãmân în balon aproximativ 0,5 ml lichid. Experimentele au arãtat cã dupã acest punct evaporarea nu mai este necesarã, şi atunci când rãmâne o cantitate de lichid de 0,5 ml acetona nu reprezintã o cantitate semnificativã. Reziduurile de acetonã rãmase pot cauza pierderi de aflatoxinã B(1) la nivelul cartuşului C(18).) Se adaugã 1 ml metanol (pct. 3.2), se agitã circular balonul pentru a dizolva aflatoxina B(1) pe lateralul balonului, se adaugã 4 ml apã şi se amestecã. Se deconecteazã şi se îndepãrteazã cartuşul. Se clãteşte coloana de apã şi se pãstreazã pentru etapa de purificare a cartuşului C(18). 5.4.2. Purificare C(18) SEP-PAK 5.4.2.1. Pregãtirea ansamblului coloanã-cartuş Se monteazã un robinet de închidere la tija scurtã a cartuşului C(18) (pct. 3.10) - figura 1. Se pregãteşte cartuşul şi se eliminã orice bulã de aer prin trecerea rapidã cu o seringã (pct. 4.19) a 10 ml metanol (pct. 3.2) prin robinet în cartuş (Bulele de aer din cartuş se vãd ca petele de luminã pe fond întunecat). Se iau 10 ml apã şi se trec 8 ml prin cartuş (A se evita pãtrunderea aerului în cartuş în momentul înlocuirii metanolului cu apa). Se monteazã tija lungã a cartuşului la o coloanã de sticlã (pct. 4.17) şi se trec cei 2 ml apã rãmaşi prin cartuş în coloanã. Se închide robinetul. Se extrage seringa. 5.4.2.2. Purificare Se transferã cantitativ extractul colectat la pct. 5.4.1.2. în coloana de sticlã (pct. 4.17), spãlând balonul cu 5 ml amestec apã/metanol (pct. 3.5.2.), lãsând sã se scurgã. În timpul acestor operaţiuni se asigurã faptul cã ansamblul coloanã-cartuş nu se usucã. (În momentul în care bulele de aer se strâng lângã cartuş se opreşte curgerea şi se îndepãrteazã partea de sus a coloanei de sticlã pentru a elimina bulele de aer. Se continuã.) Se eluteazã cu 25 ml amestec apã/metanol. Se eliminã eluatul. Se eluteazã aflatoxina B(1) cu 50 ml amestec apã/acetonã (pct. 3.5.3) şi se colecteazã tot eluatul într-un balon cotat de 50 ml. Se completeazã cu apã pânã la semn şi se amestecã: soluţia de test rezultatã este utilizatã pentru cromatografie (pct. 5.5). Atenţie! Filtrarea extractului final anterioarã HPLC nu este obligatorie. Dacã se considerã necesar filtrele din celulozã nu trebuie sã fie folosite deoarece pot produce pierderi de aflatoxinã B(1) . Sunt acceptate filtrele din teflon. 5.5. Cromatografia de înaltã performanţã cu lichid (A se vedea figura 2 pentru setarea echipamentului). A se lãsa suficient timp pentru condiţionarea şi stabilizarea instrumentelor. NOTA 1: Debitul de curgere dat de faza mobilã şi de reactivul post-coloanã are numai rol indicativ şi poate fi ajustat în funcţie de caracteristicile coloanei HPLC. NOTA 2: Rãspunsul detectorului la aflatoxina B(1) depinde de temperaturã, prin urmare derivaţiile trebuie compensate (fig. 3). Prin injectarea unei cantitãţi fixe de standard de referinţã aflatoxinã B(1) (pct. 3.13.3) la intervale regulate (de exemplu, la fiecare a treia injectare), valorile picului aflatoxinei B(1) obţinute între aceste standarde de referinţã pot fi corectate utilizând mijloace de rãspuns, cu condiţia ca diferenţa dintre rãspunsurile standardelor de referinţã consecutive sã fie foarte micã (<10%). De aceea, injectãrile trebuie sã fie efectuate fãrã întrerupere. Dacã este necesarã o întrerupere, ultima injectare înainte de întrerupere şi prima injectare dupã întrerupere trebuie sã reprezinte standardul de referinţã (pct. 3.13.3). Întrucât curba de calibrare este linearã şi trece prin origine, cantitãţile de aflatoxinã B(1) din extractele din probe sunt determinate direct prin raportare la standardele adiacente. 5.5.1. Setãrile pompei HPLC Se seteazã pompa HPLC (pct. 4.5) la un debit de curgere de 0,5 sau 0,3 ml/min. pentru o coloanã HPLC (pct. 4.6) de 5 æm sau de 3 æm, respectiv folosind faza mobilã (pct. 3.6). 5.5.2. Setãrile pompei post-coloanã Se seteazã pompa (pct. 4.7) la un debit de curgere de 0,2 pânã la 0,4 ml/min. pentru soluţie saturatã apã-iod. Debite de aproximativ 0,4 sau 0,2 ml/min. sunt recomandate în combinaţie cu debite de 0,5, respectiv 0,3 ml/min. pentru faza mobilã (pct. 3.6). 5.5.3 Detector cu fluorescenţã Se seteazã detectorul cu fluorescenţã (pct. 4.11) la excitaţie de 365 nm şi emisie de 435 nm (instrument de filtrare; > 400 nm). Se ajusteazã atenuatorul detectorului pentru a obţine aproximativ 80% din totalul devierii vârfului dispozitivului de înregistrare pentru 1 ng de aflatoxinã B(1) . 5.5.4. Injector Pentru toate soluţiile se injecteazã o cantitate de 250 æl, urmând instrucţiunile producãtorului injectorului. 5.5.5. Verificarea separãrii cromatografice Se injecteazã soluţia pentru test cromatografic (pct. 3.14.1). Şanţurile trebuie sã fie mai mici de 5% din suma înãlţimilor muchiilor adiacente. 5.5.6. Verificarea stabilitãţii sistemului Înaintea fiecãrei serii de analize se injecteazã standardul de referinţã (pct. 3.13.3) pânã ce se ating suprafaţele stabile ale muchiilor. (NB: Reacţia suprafeţei de aflatoxinã B(1) , între injectãri consecutive, nu trebuie sã difere cu mai mult de 6%). Se începe imediat verificarea linearitãţii (pct. 5.5.7). 5.5.7. Verificarea linearitãţii Se injecteazã soluţie de calibrare aflatoxinã B(1) (pct. 3.13.1 la pct. 3.13.4). Pentru evitarea aglomerãrilor în reacţie, la fiecare a treia injectare se va utiliza standard de referinţã (pct. 3.13.3) (NB: Reacţia suprafeţei superioare în cazul acestui standard de referinţã nu trebuie sã difere cu mai mult de 10% în 90 min.). Se corecteazã aglomerãrile conform formulei de la punctul 7. Graficul de calibrare trebuie sã fie linear şi sã treacã prin origine între douã erori standard pe Y. Valorile obţinute nu trebuie sã difere cu mai mult de 3% de valorile nominale. Dacã aceste condiţii sunt îndeplinite, se continuã fãrã întârziere. Dacã nu, se identificã şi se corecteazã sursa problemelor de a continua. 5.5.8. Injectarea extractelor din probe Se injecteazã extractele din probe purificate (pct. 5.4.2.2). Dupã fiecare douã extracte din probe se repetã injectarea de standard de referinţã (pct. 3.13.3), conform urmãtoarei secvenţe: standard de referinţã, extract, extract, standard de referinţã, extract, extract, standard de referinţã etc. 6. Test de confirmare 6.1. Tratarea în continuare a extractului (pct. 5.4.2.2) Se adaugã 5 ml soluţie de clorurã de sodiu (pct. 3.15.1) extractului obţinut la pct. 5.4.2.2. Se extrag de 3 ori câte 2 ml cloroform (pct. 3.1) pentru un minut, în pâlnia de separare (pct. 4.24.1). Se scurg extractele combinate cu cloroform peste aproximativ 1 g sulfat de sodiu (pct. 3.15.2) într-un tub pentru test de 10 ml. O pâlnie micã (diametru: 4 cm, poate fi folositã împreunã cu o cârpã din bumbac în partea de scurgere, acoperitã cu aproximativ 1 g sulfat de sodiu. Se spalã stratul de sulfat de sodiu cu câţiva ml cloroform şi se colecteazã soluţia rezultatã în acelaşi tub pentru test. Se evaporã extractul de cloroform pânã la uscare, în acelaşi tub pentru test, utilizând un bloc pentru încãlzire (pct. 4.24.2) şi se redizolvã în 1 ml cloroform. 6.2. Pregãtirea cromatografiei derivate şi în strat subţire: A se vedea metoda A, pct. 5.6.2. 7. Calcularea rezultatelor Se calculeazã conţinutul de aflatoxinã B(1) (æm/kg) prezent în probã, dupã formula:
V(f)
V(m) x M x ------
V(c)
unde: m = cantitatea în ng de aflatoxinã B(1) reprezentatã prin partea superioarã B(1) a probei, calculatã dupã cum urmeazã:
P(st(1)) + P(st(2))
unde: P(proba) = suprafaţa superioarã a aflatoxinei B(1) pentru probã; P(st(1)) = suprafaţa superioarã a aflatoxinei B(1) rezultatã din injectarea precedentã, cu standard de referinţã (pct. 3.13.3); P(st(2)) = suprafaţa superioarã a aflatoxinei B(1) rezultatã din injectarea urmãtoare, cu standard de referinţã (pct. 3.13.3); r(st) = cantitatea de aflatoxinã B(1) în ng injectatã în standardul de referinţã (pct. 3.13.3); V(m) = volumul în ml extras din probã injectat; V(ext) = volumul final în ml de extras din probã; M = masa în g a probei; V(f) = volumul în ml de filtrat transferat în cartuşul florisil (pct. 5.4.1.2); V(c) = volumul în ml de cloroform utilizat pentru extragerea probei. Dacã procedura este conformã acestui protocol, formula se reduce la: conţinutul de aflatoxinã B(1) în æg/kg = 20 x m. 7.1. Calcularea rezultatelor poate, de asemenea, sã fie efectuatã mãsurând înãlţimea suprafeţei superioare. 8. Repetabilitate A se vedea pct. 10.1 9. Reproductibilitate A se vedea pct. 10.1 10. Observaţii 10.1. Precizie Un studiu colaborativ^1) efectuat la nivel internaţional asupra furajelor amestecate a ajuns la rezultatele pentru repetabilitate şi reproductibilitate indicate în tabelul 1. Termenul repetabilitate (r) utilizat aici este definit ca fiind cea mai mare pondere nesemnificativã la nivelul de probabilitate de 95% pentru compararea a douã citiri ale aceleiaşi probe, în acelaşi laborator, în condiţii similare. Termenul reproductibilitate (R) este definit similar pentru compararea în cazul a douã laboratoare diferite. În conformitate cu ISO 3534 - 1977, 2,35^2) şi cu Decizia Comisiei 89/610/CEE^3), r şi R sunt daţi, de asemenea, în tabelul 1 drept coeficienţi de variaţie.---- ^1) Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. şi Paulsch, W.E. (1991). Aditivi şi Contaminanţi Alimentari 8, 17-29. ^2) ISO 3534-1977 ^3) JO nr. L 351, 2.12.1989, p. 39. Tabelul 1 Repetabilitatea (r) şi reproductibilitatea (R) exprimate proporţional şi coeficienţii de variaţie corespondenţi (15 laboratoare)
───────────────────────────────────────────────────────
Nivel r R CV(r)*) CV(R)
───────────────────────────────────────────────────────
(æg/kg) (%) (%)
───────────────────────────────────────────────────────
8 & 14 1,4 1,7 11 18
───────────────────────────────────────────────────────
Newsletter GRATUIT
Aboneaza-te si primesti zilnic Monitorul Oficial pe email
Comentarii
Fii primul care comenteaza.
