Comunica experienta
MonitorulJuridic.ro

Trimite prin Yahoo Messenger pagina: NORMA SANITARA VETERINARA din 1 februarie 2007 ce stabileste metode comunitare de analiza pentru determinarea vitaminei A, a vitaminei E si a triptofanului din furaje

Cautare document

Termen: Tipul actului: Anul publicarii actului:

Cautare document

Termen: Tipul actului: Anul publicarii actului:

Copierea de continut din prezentul site este supusa regulilor precizate in Termeni si conditii! Click aici.
Prin utilizarea siteului sunteti de acord, in mod implicit cu Termenii si conditiile! Orice abatere de la acestea constituie incalcarea dreptului nostru de autor si va angajeaza raspunderea!

NORMA SANITARA VETERINARA din 1 februarie 2007 ce stabileste metode comunitare de analiza pentru determinarea vitaminei A, a vitaminei E si a triptofanului din furaje

EMITENT: AUTORITATEA NATIONALA SANITARA VETERINARA SI PENTRU SIGURANTA ALIMENTELOR
PUBLICAT: MONITORUL OFICIAL nr. 147 din 28 februarie 2007

Comenteaza legea

ART. 1
Autoritatea veterinarã centralã a României trebuie sã solicite ca analizele efectuate în scopul controalelor oficiale pentru determinarea conţinutului de vitamina A, vitamina E şi triptofan al furajelor şi premixurilor sã fie efectuate folosindu-se metoda stabilitã în anexa la prezenta normã sanitarã veterinarã.
ART. 2
Autoritatea veterinarã centralã a României informeazã Comisia Europeanã cu privire la actele normative şi prevederile administrative necesare pentru implementarea prezentei norme sanitare veterinare.
ART. 3
Anexa face parte integrantã din prezenta normã sanitarã veterinarã.

ANEXĂ
la norma sanitarã veterinarã

PARTEA A: Determinarea vitaminei A (retinol)

1. Scop şi domeniu
Aceastã metodã se foloseşte pentru determinarea vitaminei A (retinol) din furaje şi premixuri. Vitamina A include toţi compuşii alcool trans-retinol şi izomerii cis. Conţinutul de vitamina A este exprimat în unitãţi internaţionale (UI)/kg. O unitate internaţionalã corespunde activitãţii a 0,300 æg a tuturor compuşilor alcoolici trans ai vitaminei A sau 0,344 æg a tuturor compuşilor acetaţi trans ai vitaminei A ori 0,550 æg a tuturor compuşilor palmitaţi trans ai vitaminei A. Limita de determinare este de 2.000 UI vitamina A/kg.
2. Principiul metodei
Proba este hidrolizatã cu soluţie etanolicã de hidroxid de potasiu, iar vitamina A este extrasã în eter de petrol. Solventul este înlãturat prin evaporare, iar reziduul este diluat în metanol şi, dacã este necesar, diluat pânã la concentraţia necesarã. Conţinutul de vitamina A este determinat prin lichid cromatografie de înaltã performanţã cu fazã inversã (RP-HPLC), folosindu-se un detector cu UV sau cu fluorescentã. Parametrii cromatografici sunt aleşi astfel încât sã nu existe nicio diferenţã între toţi compuşii alcoolici trans ai vitaminei A şi izomerii cis.
3. Reactivi:
3.1. Etanol, c = 96%, anhidru
3.2. Eter de petrol, interval de fierbere 40°-60°C
3.3. Metanol
3.4. Soluţie de hidroxid de potasiu, â = 50 g/100 ml
3.5. Soluţia de ascorbat de sodiu, â = 10 g/100 ml (a se vedea observaţiile de la pct. 7.7)
3.6. Sulfit de sodiu, Na(2)S x H(2)O (x = 7-9)
3.6.1. Soluţie de sulfit de sodiu, c = 0,5 mol/l în glicerol, â = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observaţiile de la pct. 7.8)
3.7. Soluţie de fenoftaleinã, â = 2 g/100 ml în etanol (pct. 3.1)
3.8. 2-Propanol
3.9. Faza mobilã pentru HPLC: amestec de metanol (pct. 3.3) şi apã, de exemplu 980 + 20 (v + v). Raportul exact trebuie determinat prin intermediul caracteristicilor coloanei folosite.
3.10. Azot, liber de oxigen
3.11. Acetat de vitamina A trans total, extrapur, cu activitate certificatã, de exemplu 2,80 x 10^6 UI/g
3.11.1. Soluţie stoc din vitamina A acetat trans total: se cântãresc, cu aproximaţie de 0,1 mg, 50 mg din acetat de vitamina A (pct. 3.11) într-un balon cotat de 100 ml. Se dizolvã în 2-propanol (pct. 3.8) şi se completeazã pânã la semn cu acelaşi solvent. Concentraţia nominalã a acestei soluţii este de 1.400 UI vitamina A/ml. Conţinutul exact trebuie determinat în conformitate cu pct. 5.6.3.1.
3.12. Palmitat de vitamina A, extrapur, cu activitate certificatã, de exemplu 1,80 x 10^6 UI/g
3.12.1. Soluţie stoc din retinol palmitat trans total: se cântãresc, cu aproximaţie de 0,1 mg, 80 mg din palmitat de vitamina A (pct. 3.12) într-un balon cotat de 100 ml. Se dizolvã în 2-propanol (pct. 3.8) şi se completeazã pânã la semn cu acelaşi solvent. Concentraţia nominalã a acestei soluţii este de 1.400 UI vitamina A/ml. Conţinutul exact trebuie determinat în conformitate cu pct. 5.6.3.2.
3.13. 2,6-di-tert-butil-4-metilfenol (BHT) (a se vedea observaţiile de la pct. 7.5).
4. Aparaturã:
4.1. Evaporator rotativ cu vacuum
4.2. Sticlãrie brunã
4.2.1. Baloane cu fund plat sau conice de 500 ml, cu şlif
4.2.2. Baloane cotate cu dopuri rodate, cu gât îngust, cu capacitate de 10, 25, 100 şi 500 ml
4.2.3. Pâlnii de separare, conice, de 1.000 ml, cu dopuri din sticlã
4.2.4. Baloane piriforme din sticlã de 250 ml cu şlif
4.3. Condensator Allihn, de 300 mm, cu legãturã din sticlã, cu adaptator pentru o pipã de aprovizionare cu gaz
4.4. Hârtie de filtru pentru separarea fazicã, cu diametrul de 185 mm (de exemplu Schleicher & Schuell 597 HY(1/2) sau similar)
4.5. Lichid cromatografie de înaltã presiune (echipament HPLC cu sistem de injecţie)
4.5.1. Coloanã de lichid cromatografie, 250 mm x 4 mm, C(18), de 5 sau 10 æm sau echivalent (criteriu de performanţã: doar un singur peak pentru toţi izomerii retinolului în baza condiţiilor HPLC)
4.5.2. Detector UV sau de fluorescentã, cu ajustare variabilã a lungimii de undã
4.6. Spectrofotometru cu cuve de cuarţ de 10 mm
4.7. Baie de apã cu agitator magnetic
4.8. Aparat de extracţie ce constã din:
4.8.1. Cilindru de sticlã cu capacitate de 1 l, echipat cu gât şi dop rodat;
4.8.2. Mufã rodatã, echipatã cu un braţ exterior şi un tub ajustabil ce trece prin centru. Tubul ajustabil trebuie sã aibã un capãt în formã de U în partea de jos şi o parte efilatã la partea opusã, astfel încât stratul superior de lichid din cilindru sã poatã fi transferat într-un tub de separare.
5. Procedurã
NOTĂ:
Vitamina A este sensibilã la luminã (UV) şi oxidare. Toate operaţiunile trebuie efectuate în absenţa luminii (folosindu-se sticlãrie brunã sau sticlãrie protejatã cu folie de aluminiu) şi a oxigenului (a se purja cu azot). În timpul extracţiei aerul de deasupra lichidului trebuie înlocuit cu azot (evitaţi presiunea în exces prin lãrgirea dopului din când în când).
5.1. Pregãtirea probei
Se mãrunţeşte proba astfel încât sã treacã printr-o sitã cu ochiuri de 1 mm, avându-se grijã sã se evite generarea de cãldurã. Mãrunţirea trebuie efectuatã imediat înainte de cântãrire şi saponificare, altfel ar putea avea loc pierderi de vitamina A.
5.2. Saponificarea
În funcţie de conţinutul de vitamina A, se cântãresc, cu aproximaţie de 0,01 g, 2 pânã la 25 g din probã, într-un balon de 500 ml cu fundul plat sau conic (pct. 4.2.1). Se adaugã în continuare, prin amestecare, 130 ml etanol (pct. 3.1), aproximativ 100 mg BHT (pct. 3.13), 2 ml soluţie de ascorbat de sodiu (pct. 3.5) şi 2 ml soluţie de sulfit de sodiu (pct. 3.6). Se potriveşte un condensator (pct. 4.3) la balon şi se scufundã balonul într-o baie de apã cu agitator magnetic (pct. 4.7). Se încãlzeşte pânã la fierbere şi se lasã la reflux timp de 5 minute. Se adaugã apoi 25 ml soluţie de hidroxid de potasiu (pct. 3.4) prin condensator (pct. 4.3) şi se lasã la reflux timp de 25 de minute, agitându-se sub un flux uşor de azot. Apoi se clãteşte condensatorul cu aproximativ 20 ml apã şi se rãceşte conţinutul balonului la temperatura camerei.
5.3. Extracţie
Se transferã prin decantare întreaga soluţie saponificatã, prin clãtire cu un volum total de 250 ml apã într-o pâlnie de separare de 1.000 ml (pct. 4.2.3) sau în aparatul de extracţie (pct. 4.8). Se clãteşte balonul de saponificare în continuare cu 25 ml etanol (pct. 3.1) şi 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) şi se transferã soluţiile de clãtire în pâlnia de separare sau în aparatul de extracţie. Proporţia de apã şi etanol în soluţiile combinate ar trebui sã fie de 2:1. Se agitã viguros timp de douã minute şi se lasã sã se sedimenteze timp de douã minute.
5.3.1. Extracţie folosind un tub de separare (pct. 4.2.3)
Când straturile de lichid s-au separat (a se vedea observaţia de la pct. 7.3), se transferã stratul de eter de petrol într-o altã pâlnie de separare (pct. 4.2.3). Se repetã aceastã extracţie de douã ori, cu 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) şi de douã ori cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2). Se spalã extractele combinate în pâlnia de separare, de douã ori, prin amestecare uşoarã - pentru a se evita formarea emulsiilor - cu cantitãţi de 100 ml apã şi dupã agitare repetatã alte cantitãţi de 100 ml apã, pânã când apa rãmâne incolorã la adãugarea soluţiei de fenoftaleinã (pct. 3.7) - spãlarea de patru ori este suficientã. Se filtreazã extractul spãlat printr-un filtru de hârtie pentru separare fazicã (pct. 4.4), pentru a se înlãtura orice cantitate de apã în suspensie, într-un balon cotat de 500 ml (pct. 4.2.2). Se spalã pâlnia de separare şi filtrul cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2), se umple pânã la semn cu eter de petrol (pct. 3.2) şi se amestecã bine.
5.3.2. Extracţie folosind un aparat de extracţie (pct. 4.8)
Când straturile s-au separat (a se vedea observaţia de la pct. 7.3), se înlocuieşte dopul cilindrului de sticlã (pct. 4.8.1) prin inserţie din sticlã matã (pct. 4.8.2) şi se aranjeazã capãtul de mai jos în formã de U al tubului ajustabil, astfel încât sã se afle deasupra nivelului interfeţei. Prin aplicarea unei presiuni de la generatorul de azot prin braţul exterior, se transferã stratul superior de eter de petrol într-un tub de separare de 1.000 ml (pct. 4.2.3). Se adaugã 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) în cilindrul de sticlã (al aparatului), se ataşeazã dopul şi se agitã bine. Se lasã straturile sã se separe şi se transferã stratul de deasupra în tubul de separare, la fel ca înainte. Se repetã procedura extracţiei cu încã 100 ml eter de petrol (pct. 3.2), apoi de douã ori cu cantitãţi de 50 ml eter de petrol (pct. 3.2) şi se adaugã straturile de eter de petrol în tubul de separare. Se spalã extractele combinate din eter de petrol, dupã cum este descris la pct. 5.3.1, şi se procedeazã dupã cum este descris la acel punct.
5.4. Prepararea soluţiei probã pentru HPLC
Se pipeteazã o cantitate alicotã din soluţia de eter de petrol (de la pct. 5.3.1 la pct. 5.3.2) într-un balon în formã de parã de 250 ml (pct. 4.2.4). Se evaporã solventul pânã aproape de sec, la evaporatorul rotativ (pct. 4.1), cu presiune redusã, la o temperaturã a bãii de apã ce nu depãşeşte 40°C. Se restabileşte presiunea atmosfericã prin admisie de nitrogen (pct. 3.10) şi se îndepãrteazã balonul de pe evaporatorul rotativ. Se înlãturã solventul rãmas în curent de azot (pct. 3.10) şi se dizolvã imediat reziduul cu un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (pct. 3.3) (concentraţia de vitamina A trebuie sã fie între 5 UI/ml şi 30 UI/ml).
5.5. Efectuarea determinãrii prin HPLC
Vitamina A este separatã pe o coloanã C(18) cu fazã inversã (pct. 4.5.1), iar concentraţia este mãsuratã printr-un detector de UV (325 nm) sau un detector de fluorescentã (excitaţie: 325 nm, emisie: 475 nm) (pct. 4.5.2). Se injecteazã o cantitate alicotã (de exemplu 20 æl) de soluţie metanolicã obţinutã conform pct. 5.4 şi se elueazã cu faza mobilã (pct. 3.9). Se calculeazã media peak-urilor înãlţimii mai multor injecţii din aceeaşi soluţie de probã şi media peak-urilor înãlţimii mai multor injecţii ale soluţiilor de calibrare (pct. 5.6.2).
Condiţii de separare HPLC
Sunt oferite urmãtoarele condiţii pentru instruire; pot fi folosite alte condiţii, cu obligaţia ca acestea sã ofere rezultate echivalente.
Coloana de lichid cromatografie (pct. 4.5.1): 250 mm x 4 mm, C(18) de 5 sau 10 æm ori echivalent
Faza mobilã (pct. 3.9): amestec de metanol (pct. 3.3) şi apã, de exemplu 980 + 20 (v + v)
Rata de curgere: 1-2 ml/min.
Detector (pct. 4.5.2): detector cu UV (325 nm) sau detector cu fluorescentã (excitaţie: 325 nm/emisie: 475 nm)
5.6. Calibrare
5.6.1. Prepararea soluţiilor standard de lucru
Se pipeteazã 20 ml soluţie stoc de acetat vitamina A (pct. 3.11) sau 20 ml soluţie stoc de palmitat vitamina A (pct. 3.12.1) într-un balon cu fund plat sau conic (pct. 4.2.1) şi se hidrolizeazã dupã cum este descris la pct. 5.2, dar fãrã a se adãuga BHT. Se aplicã apoi extracţia cu eter de petrol (pct. 3.2) în conformitate cu pct. 5.3 şi se completeazã pânã la 500 ml cu eter de petrol (pct. 3.2). Se evaporã 100 ml din acest extract pe evaporatorul rotativ (a se vedea pct. 5.4) pânã aproape de sec, se înlãturã solventul rãmas cu un curent de azot (pct. 3.10) şi se redizolvã reziduul în 10,0 ml metanol (pct. 3.3). Concentraţia nominalã a acestei soluţii este 560 UI vitamina A/ml. Conţinutul exact trebuie determinat în conformitate cu pct. 5.6.3.3. Soluţia standard de lucru trebuie preparatã proaspãtã, înainte de folosire. Se pipeteazã 2,0 ml din aceastã soluţie standard de lucru, într-un balon cotat de 20 ml, se completeazã cu metanol pânã la semn (pct. 3.3) şi se amestecã. Concentraţia nominalã a acestei soluţii standard de lucru diluate este de 56 UI de vitamina A/ml.
5.6.2. Prepararea soluţiilor de calibrare şi a graficului de calibrare: se transferã 1,0; 2,0; 5,0 şi 10,0 ml din soluţia standard de lucru, diluatã într-o serie de baloane cotate de 20 ml, se completeazã pânã la semn cu metanol (pct. 3.3) şi se amestecã. Concentraţiile nominale ale acestor soluţii sunt 2,8; 5,6; 14,0 şi 28,6 UI de vitamina A/ml. Se injecteazã 20 æl din fiecare soluţie de calibrare de mai multe ori şi se determinã media înãlţimilor peack-urilor. Folosindu-se media înãlţimilor peack-urilor, se întocmeşte o curbã de calibrare, luându-se în considerare rezultatele obţinute în UV (pct. 5.6.3.3).
5.6.3. Standardizarea UV a soluţiilor standard
5.6.3.1. Soluţie stoc acetat de vitamina A
Se pipeteazã 2,0 ml din soluţia stoc acetat de vitamina A (pct. 3.11.1) într-un balon cotat de 50 ml (pct. 4.2.2) şi se completeazã pânã la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentraţia nominalã a acestei soluţii este de 56 UI vitamina A/ml. Se pipeteazã 3,0 ml din aceastã soluţie de acetat de vitamina A într-un balon cotat de 25 ml şi se completeazã pânã la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentraţia nominalã a acestei soluţii este de 6,72 UI vitamina A/ml. Se mãsoarã spectrul UV al acestei soluţii faţã de 2-propanol (pct. 3.8) cu un spectrofotometru (pct. 4.6), la o lungime de undã între 300 nm şi 400 nm. Extincţia maximã trebuie sã fie între 325 nm şi 327 nm.
Calcularea conţinutului de vitamina A:

UI vitamina A/ml = E(326) x 19,0
[E(1cm)^1% pentru vitamina A acetat = 1.530 la 326 nm în 2-propanol]

5.6.3.2. Palmitatul de vitamina A soluţia stoc
Se pipeteazã 2,0 ml de vitamina A palmitat din soluţia stoc (pct. 3.12.1) într-un balon cotat de 50 ml (4.2.2) si se completeazã pânã la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentraţia nominalã a acestei soluţii este de 56 UI vitamina A/ml. Se pipeteazã 3,0 ml din aceastã soluţie diluatã de vitamina A palmitat într-un balon cotat de 25 ml şi se completeazã pânã la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentraţia nominalã a acestei soluţii este de 6,72 UI vitamina A/ml. Se mãsoarã spectrul UV al acestei soluţii faţã 2-propanolului (pct. 3.8) cu spectrofotometrul (pct. 4.6) fixat la o lungime de undã între 300 nm si 400 nm. Extincţia maximã trebuie sã fie între 325 nm si 327 nm.
Calcularea conţinutului de vitamina A:

UI vitamina A/ml = E(326) x 19,0
[E(1cm)^1% pentru vitamina A palmitat = 1.530 la 326 nm în 2-propanol]

5.6.3.3. Vitamina A = Soluţie standard de lucru. Se pipeteazã 3,0 ml din soluţia standard de vitamina A nediluatã, preparatã în conformitate cu pct. 5.6.1, într-un balon cotat de 50 ml (pct. 4.2.2) şi se completeazã pânã la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Se pipeteazã 5 ml din aceastã soluţie într-un balon cotat de 25 ml şi se aduce la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentraţia nominalã a acestei soluţii este de 6,72 UI de vitamina A/ml. Se mãsoarã spectrul acestei soluţii faţã de 2-propanol (pct. 3.8) cu spectrofotometrul (pct. 4.6) la lungime de undã între 300 nm şi 400 nm. Extincţia maximã trebuie sã fie între 325 nm şi 327 nm.
Calcularea conţinutului în vitamina A:

UI vitamina A/ml = E(325) x 18,3
[E(1cm)^1% pentru retinol = 1.821 la 325 nm în 2-propanol]

6. Calcularea rezultatelor
Pornindu-se de la înãlţimea medie a peak-urilor de vitamina A a soluţiei de probã, se determinã concentraţia soluţiei de probã în UI/ml, prin referire faţã de curba de calibrare (pct. 5.6.2).
Conţinutul w de vitamina A în UI/kg al probei este dat de urmãtoarea formulã:


         500 x â x V(2)

V(1) x m

în care:
â = concentraţia de vitamina A din soluţia de probã (pct. 5.4) la UI/ml;
V(1) = volumul soluţiei de probã (pct. 5.4), în ml;
V(2) = volumul cantitãţii alicote luate conform pct. 5.4, în ml;
m = masa de probã luatã în lucru, în g.
7. Observaţii
7.1. Pentru probe cu concentraţie redusã de vitamina A poate fi util sã se combine extractele de eter de petrol din douã încãrcãturi de saponificare (cantitate cântãritã = 25 g) într-o soluţie de probã pentru determinare HPLC.
7.2. Cantitatea probei utilizate pentru analizã nu ar trebui sã conţinã mai mult de 2 g grãsime.
7.3. Dacã separarea fazicã nu are loc, adãugaţi aproximativ 10 ml etanol (pct. 3.1) pentru a întrerupe emulsia.
7.4. Pentru ulei din ficat de cod şi alte grãsimi pure timpul de saponificare trebuie sã fie extins la 45-60 de minute.
7.5. Poate fi folositã hidrochinonã în loc de BHT.
7.6. Folosindu-se o coloanã fazicã normalã, este posibilã separarea de izomeri de retinol.
7.7. Se pot folosi aproximativ 150 mg de acid ascorbic în loc de soluţie de ascorbat de sodiu.
7.8. Se pot folosi aproximativ 50 mg EDTA în loc de soluţia de sulfit de sodiu.
8. Repetabilitate
Diferenţa dintre rezultatele a douã determinãri paralele, efectuate pe aceeaşi probã, nu trebuie sã depãşeascã 15%, valoare relativã faţã de cel mai mare rezultat.
9. Rezultate ale unui studiu de colaborare*)
------
*) = Realizat de grupul de lucru pentru furaje din Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs-und Forschungsanstalten (VDLUFA)


┌────────────┬────────────┬────────────┬────────────┬────────────┬───────────┐
│            │   Premix   │   Furaj    │ Concentrat │   Furaj    │  Purcel   │
│            │            │ cu premix  │  mineral   │  proteic   │           │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│ L          │    13      │   12       │      13    │      12    │     13    │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│ n          │    48      │   45       │      47    │      46    │     49    │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│medie       │17,02 x 10^6│ 1,21 x 10^6│   537.100  │   151.800  │   18.070  │
│[UI/kg]     │            │            │            │            │           │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│s(r)        │0,51 x 10^6 │0,039 x 10^6│    22.080  │    12.280  │     682   │
│[UI/kg]     │            │            │            │            │           │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│r           │1,43 x 10^6 │0,109 x 10^6│    61.824  │    34.384  │   1.910   │
│[UI/kg]     │            │            │            │            │           │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│CV(r)[%]    │  3,0       │  3,5       │      4,1   │      8,1   │     3,8   │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│s(R)        │1,36 x 10^6 │0,069 x 10^6│    46.300  │   23.060   │    3.614  │
│[UI/kg]     │            │            │            │            │           │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│R [UI/kg]   │3,81 x 10^6 │0,193 x 10^6│   129.640  │   64.568   │   10.119  │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│CV(R)       │  8,0       │  6,2       │      8,6   │      15    │     20    │
│[%]         │            │            │            │            │           │
└────────────┴────────────┴────────────┴────────────┴────────────┴───────────┘

L: numãr de laboratoare
n: numãr de valori singulare
S(r): deviaţia standard a repetabilitãţii
s(R): deviaţia standard a reproductibilitãţii
r: repetabilitate
R: reproductibilitate
CV(r): coeficient de variaţie al repetabilitãţii
CV(R): coeficient de variaţie al reproductibilitãţii

Fig. 1. Aparatul de extracţie (4.8.)

NOTĂ(CTCE)
Fig. 1. Aparatul de extracţie (4.8.), se gãseşte în Monitorul Oficial al României, Partea I, Nr. 147 din 28.02.2007, la pagina 6 (a se vedea imaginea asociatã).

PARTEA B: Determinarea vitaminei E (tocoferol)

1. Scop şi domeniu
Aceastã metodã se foloseşte pentru determinarea vitaminei E din furaje şi premixuri. Conţinutul de vitamina E este exprimat ca mg de DL acetat de tocoferol/kg. Astfel, 1 mg DL acetat de tocoferol corespunde la 0,91 mg DL tocoferol (vitamina E).
Limita de determinare este de 2 mg vitamina E/kg.
2. Principiu
Proba este hidrolizatã cu soluţie de hidroxid de potasiu etanolic, iar vitamina E este extrasã în eter de petrol. Solventul este înlãturat prin evaporare, iar reziduul este dizolvat în metanol şi, dacã este necesar, diluat pânã la concentraţia necesarã. Conţinutul de vitamina E este determinat prin lichid cromatografie de înaltã performanţã cu fazã inversatã (RP-HPLC), folosindu-se un detector cu fluorescentã sau UV.
3. Reactivi
3.1. Etanol, c = 96%
3.2. Eter de petrol, fracţia 40°C - 60°C
3.3. Metanol
3.4. Soluţie de hidroxid de potasiu, â = 50 g/100 ml
3.5. Soluţie de ascorbat de sodiu, â = 10 g/100 ml (a se vedea observaţiile de la pct. 7.7)
3.6. Sulfit de sodiu, Na(2)S x H(2)O (x = 7-9)
3.6.1. Soluţie de sulfit de sodiu, c = 0,5 mol/l în glicerol, â = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observaţiile de la pct. 7.8)
3.7. Soluţie de fenolftaleinã, â = 2 g/100 ml în etanol (pct. 3.1)
3.8. Faza mobilã pentru HPLC: amestec de metanol (pct. 3.3) şi apã, de exemplu: 980 + 20 (v + v). Raportul exact trebuie sã fie determinat prin intermediul caracteristicilor coloanei folosite.
3.9. Azot liber de oxigen
3.10. DL-α-tocoferol acetat, extrapur, cu activitate certificatã
3.10.1. Soluţie stoc din DL-α-acetat de tocoferol: se cântãresc, cu aproximaţie de 0,1 mg, 100 mg DL-α-acetat de tocoferol (pct. 3.10) într-un balon cotat de 100 ml. Se dizolvã în etanol (pct. 3.1) şi se completeazã pânã la semn cu acelaşi solvent. Astfel, 1 ml din aceastã soluţie conţine 1 mg DL-a-acetat de tocoferol (pentru control UV, a se vedea pct. 5.6.2.3; pentru stabilizare, a se vedea observaţiile de la pct. 7.4)
3.11. DL-α-tocoferol, extrapur, cu activitate certificatã
3.11.1. Se cântãresc, cu aproximaţie de 0,1 mg, 100 mg de DL-α-tocoferol (pct. 3.10) într-un balon gradat de 100 ml. Se dizolvã în etanol (pct. 3.1) şi se completeazã pânã la semn cu acelaşi solvent. Astfel, 1 ml din aceastã soluţie conţine 1 mg DL-α-tocoferol (pentru control UV, a se vedea pct. 5.6.2.3; pentru stabilizare, a se vedea observaţiile de la pct. 7.4).
3.12. 2,6 di'adterţ-butil-metilfenol (BHT) (a se vedea observaţiile de la pct. 7.5).
4. Aparaturã:
4.1. Evaporator rotativ cu vacuum
4.2. Sticlãrie brunã
4.2.1. Baloane cu fund plat sau conice de 500 ml, cu slif
4.2.2. Baloane cotate, cu dopuri rodate, cu gât strâmt, cu capacitate de 10, 25, 100 şi 500 ml
4.2.3. Pâlnii de separare conice, de 1.000 ml, cu dopuri de sticlã
4.2.4. Baloane piriforme din sticlã de 250 ml cu gât rodat
4.3. Condensator Allihn, de 300 mm, cu legãturã din sticlã, cu adaptator pentru o pipã de aprovizionare cu gaz
4.4. Hârtie de filtru pentru separare fazicã, cu diametrul de 185 mm (de exemplu Schieicher & Schuell 597 HY 1/2 sau similar).
4.5. Echipament HPLC cu sistem de injecţie
4.5.1. Coloana de lichid cromatografie, 250 mm x 4 mm, C(18), de 5 ori 10 æm sau echivalent
4.5.2. Detector UV sau de fluorescentã, cu ajustare variabilã a lungimii de undã
4.6. Spectrofotometru cu cuve de cuarţ de 10 mm
4.7. Baie de apã cu agitator magnetic
4.8. Aparat de extracţie constând în:
4.8.1. Cilindru de sticlã, de capacitate de 1 l, cãruia i se pun un gât şi dop de sticlã
4.8.2. Mufã din sticlã matã, echipatã cu un braţ exterior şi cu un tub ajustabil ce trece prin centru. Tubul ajustabil trebuie sã aibã un capãt în formã de U situat în partea de jos şi un capãt efilat la partea opusã, astfel încât stratul superior de lichid din cilindru sã poatã fi transferat într-o pâlnie de separare.
5. Procedurã
NOTĂ:
Vitamina E este sensibilã la luminã (UV) şi oxidare. Toate operaţiunile trebuie efectuate în absenţa luminii (folosindu-se sticlãrie brunã sau sticlãrie protejatã cu folie de aluminiu) şi a oxigenului (a se spãla cu azot). În timpul extracţiei, aerul de deasupra lichidului trebuie înlocuit de azot (a se evita presiunea prin lãrgirea dopului din când în când).
5.1. Pregãtirea probei: se mãrunţeşte proba astfel încât sã treacã printr-o sitã cu ochiuri de 1 mm, avându-se grijã sã se evite generarea de cãldurã. Mãrunţirea trebuie efectuatã imediat înainte de cântãrire şi saponificare, altfel pot avea loc pierderi de vitamina E.
5.2. Saponificare: în funcţie de conţinutul de vitamina E, se cântãresc, cu aproximaţie de 0,01 g, 2 pânã la 25 g din probã într-un balon de 500 ml cu fundul plat sau conic (pct. 4.2.1). Se adaugã în continuare, prin amestecare, 130 ml etanol (pct. 3.1), aproximativ 100 mg BHT (pct. 3.12), 2 ml soluţie de ascorbat de sodiu (pct. 3.5) şi 2 ml soluţie de sulfit de sodiu (pct. 3.6). Se potriveşte un condensator (pct. 4.3) la balon şi se scufundã balonul într-o baie de apã cu agitator mecanic (pct. 4.7). Se încãlzesc pânã la fierbere şi se lasã la reflux timp de 5 minute. Se adaugã apoi 25 ml soluţie de hidroxid de potasiu (pct. 3.4) prin condensator (pct. 4.3) şi se lasã la reflux timp de 25 de minute, agitându-se sub un flux uşor de azot. Apoi se clãteşte condensatorul cu aproximativ 20 ml apã şi se rãceşte conţinutul balonului la temperatura camerei.
5.3. Extracţie: se transferã, prin decantare, întreaga soluţie de saponificare, prin clãtire cu un volum total de 250 ml apã, într~o pâlnie de separare de 1.000 ml, (pct.4.2.3) sau în aparatul de extracţie (pct. 4.8). Se clãteşte balonul de saponificare, în continuare, cu 25 ml etanol (pct. 3.1) şi 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) şi se transferã soluţiile de clãtire în tubul de separare sau în aparatul de extracţie. Proporţia de apã şi etanol în soluţiile combinate trebuie sã fie 2:1. Se scuturã viguros timp de douã minute şi se lasã sã se sedimenteze timp de douã minute.
5.3.1. Extracţie folosind o pâlnie de separare (pct. 4.2.3); când straturile de lichid s-au separat (a se vedea pct. 7.3), se transferã stratul de eter de petrol într-o altã pâlnie de separare (pct. 4.2.3). Se repetã aceastã extracţie de douã ori cu 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) şi de douã ori cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2). Se spalã extractele combinate din pâlnia de separare de douã ori, prin amestecare uşoarã (pentru a se evita formarea emulsiilor), cu cantitãţi de 100 ml apã şi dupã agitare repetatã alte cantitãţi de 100 ml apã, pânã când apa rãmâne incolorã la adãugarea soluţiei de fenolftaleinã (pct. 3.7) (spãlarea de 4 ori este de obicei suficientã). Se filtreazã extractul spãlat printr~un filtru împãturit, pentru separare fazicã (pct. 4.4), pentru a se înlãtura orice cantitate de apã în suspensie, într-un balon cotat de 500 ml (pct. 4.2.2). Se spalã pâlnia de separare şi filtrul cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2), se umple pânã la semn cu eter de petrol (pct. 3.2) şi se amestecã bine.
5.3.2. Extracţie folosind un aparat de extracţie (pct. 4.8); când straturile s-au separat (a se vedea observaţia de la pct. 7.3) se înlocuieşte dopul cilindrului de sticlã (pct. 4.8.1) cu inserţie din sticlã matã (pct. 4.8.2) şi se aranjeazã capãtul de jos în formã de U al tubului ajustabil, astfel încât sã se afle deasupra nivelului interfeţei. Prin aplicarea unei presiuni de la generatorul nitrogenului, prin braţul exterior, se transferã stratul superior de eter de petrol într-un tub de separare de 1.000 ml (pct. 4.2.3). Se adaugã 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) în cilindrul de sticlã, se ataşeazã dopul şi se agitã bine. Se lasã straturile sã se separe şi se transferã stratul de deasupra în tubul de separare ca şi mai înainte. Se repetã procedura extracţiei cu încã 100 ml eter de petrol (pct. 3.2), apoi de douã ori cu cantitãţi de 50 ml eter de petrol (pct. 3.2) şi se adaugã straturile de eter de petrol în tubul de separare. Se spalã extractele combinate din eter de petrol, dupã cum este descris la pct. 5.3.1, şi se procedeazã dupã cum este descris acolo.
5.4. Prepararea soluţiei probã pentru HPLC: se pipeteazã o cantitate alicotã din soluţia de eter de petrol (de la pct. 5.3.1 la pct. 5.3.2) într-un balon în formã de parã, de 250 ml (pct. 4.2.4). Se evaporã solventul aproape de uscare pe evaporatorul rotativ (pct. 4.1) cu presiune redusã, la o temperaturã a bãii ce nu depãşeşte 40°C. Se readuce la presiunea atmosfericã prin admisie de azot (pct. 3.9) şi se îndepãrteazã balonul de pe evaporatorul rotativ. Se înlãturã solventul rãmas printr-un curent de azot (pct. 3.9) şi se dizolvã imediat reziduul cu un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (pct. 3.3) (concentraţia de L-α-tocoferol trebuie sã fie între 5 æ/ml şi 30 æg/ml).
5.5. Determinare prin HPLC: vitamina E este separatã pe o coloanã cu fazã inversatã de C(18) (pct. 4.5.1), iar concentraţia este mãsuratã printr-un detector de fluorescentã (excitaţie: 295 nm, emisie: 330 nm) sau un detector de UV (292 nm) (pct. 4.5.2). Se injecteazã o fracţie alicotã (de exemplu: 20 æl) de soluţie metanolicã obţinutã conform pct. 5.4 şi se realizeazã o eluţie cu faza mobilã (pct. 3.8). Se calculeazã media înãlţimii peak-ului mai multor injecţii din aceeaşi soluţie de probã şi mediile înãlţimii peak-ului ale mai multor injecţii ale soluţiilor de calibrare (pct. 5.6.2).
Condiţii HPLC: Sunt oferite urmãtoarele condiţii pentru orientare; pot fi folosite alte situaţii, cu condiţia ca acestea sã ofere rezultate echivalente.
Coloanã de lichid cromatografic (pct. 4.5.1): 250 mm x 4 mm, C(18), ambalaje de 5 æm sau 10 æm sau echivalent
Faza mobilã (pct. 3.8): amestec de metanol (pct. 3.3) şi apã, de exemplu: 980 + 20 (v + v)
Debit: 1-2 ml/min
Detector (pct. 4.5.2): detector cu fluorescentã
(excitaţie: 295 nm, emisie: 330 nm) sau detector de UV (292 nm)
5.6. Calibrare (DL acetat de tocoferol sau DL-α-tocoferol)
5.6.1. DL acetat de tocoferol standard de referinţã
5.6.1.1. Prepararea soluţiei standard de lucru
Se transferã cu o pipetã 25 ml soluţie de DL acetat de tocoferol (pct. 3.10.1) într-un balon de 500 ml cu fund plat sau conic (pct. 4.2.1) şi se hidrolizeazã dupã cum este descris la pct. 5.2. Apoi se extrage cu eter de petrol (pct. 3.2), în concordanţã cu pct. 5.3, şi se completeazã pânã la 500 ml cu eter de petrol (pct. 3.2). Se evaporã 25 ml din acest extract pe evaporatorul rotativ (a se vedea pct. 5.4) pânã aproape de uscare, se înlãturã solventul rãmas cu un curent de azot (pct. 3.9) şi se redizolvã reziduurile în 25,0 ml metanol (pct. 3.3). Concentraţia nominalã a acestei soluţii este 45,5 æg DL-α-tocoferol/ml, echivalent cu 50 æg DL-α-tocoferol acetat/ml. Soluţia standard de lucru trebuie preparatã proaspãtã, înainte de folosire.
5.6.1.2. Prepararea soluţiilor de calibrare sau a curbei de calibrare: se transferã 1,0, 2,0, 4,0 şi 10,0 ml din soluţia standard de lucru într-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completeazã pânã la semn cu metanol (pct. 3.3) şi se amestecã. Concentraţiile nominale ale acestor soluţii sunt: 2,5; 5,0; 10,0 şi 25,0 æg/ml DL-α-tocoferol acetat, de exemplu: 2,28, 4.55, 9,10 æg/ml şi 22,8 æg/ml DL-α-tocoferol. Se injecteazã 20 æl din fiecare soluţie de calibrare, de mai multe ori, şi se determinã media înãlţimii peak-ului. Folosindu-se media înãlţimilor peak-ului, se întocmeşte un grafic de calibrare.
5.6.1.3. Standardizarea UV a soluţiei de tocoferol acetat (pct. 3.10.1)
Se dizolvã 5,0 ml soluţie de tocoferol acetat (pct. 3.10.1) pânã la 25,0 ml cu etanol şi se mãsoarã spectrul UV al soluţiei faţã de etanol (pct. 3.1) cu un spectrofotometru (pct. 4.6) la o lungime de undã între 250 nm şi 320 nm.
Absorbţia maximã trebuie sã fie la 284 nm:
E(tcm)^1% = 43,6 la 284 nm în etanol
La aceastã dilutie trebuie obţinutã o valoare de extincţie de 0,84 - 0,88.
5.6.2. DL-α-tocoferol standard de referinţã
5.6.2.1. Prepararea soluţiei standard de lucru
Se transferã cu pipeta 2,0 ml soluţie de tocoferol acetat (pct. 3.11.1) într-un balon cotat de 50 ml, se dizolvã în metanol (pct. 3.3) şi se completeazã pânã la semn cu metanol. Concentraţia nominalã a acestei soluţii este de 40 æg DL-α-tocoferol/ml, echivalent cu 44,0 æg de tocoferol acetat/ml. Soluţia standard de lucru trebuie preparatã proaspãtã înainte de folosire.
5.6.2.2. Prepararea soluţiilor de calibrare şi a graficului de calibrare
Se transferã 1,0; 2,0; 4,0 şi 10,0 ml din soluţia standard de lucru diluatã într-o serie de baloane cotate de 20 ml, se completeazã pânã la semn cu metanol (pct. 3.3) şi se amestecã. Concentraţiile nominale ale acestor soluţii sunt: 2,0; 4,0; 8,0 şi 20,0 æg/ml şi 22,0 æg/ml tocoferol acetat. Se injecteazã 20 æl din fiecare soluţie de calibrare de mai multe ori şi se determinã mediile înãlţimii peak-ului. Folosindu-se mediile înãlţimii peak-ului, se întocmeşte un grafic de calibrare.
5.6.2.3. Standardizarea UV a soluţiei DL-α-tocoferol (pct. 3.11.1)
Se dizolvã 2,0 ml pânã la 25,0 ml din soluţia stoc de tocoferol (pct. 3.11.1) cu etanol (pct. 3.1) şi se mãsoarã spectrul UV al acestei soluţii faţã de etanol cu spectrofotometru (pct. 4.6) la lungime de undã între 250 nm şi 320 nm.
Absorbţia maximã trebuie sã fie la 292 nm:
E(tcm)^1% = 75,8 la 292 nm în etanol.
La aceastã diluţie trebuie obţinutã o valoare de extincţie de 0,6.
6. Calcularea rezultatelor
Pornindu-se de la media înãlţimii peak-ului pentru vitamina E a soluţiei de probã, se determinã concentraţia soluţiei de probã în æg/ml (calculatã ca α-tocoferol acetat) faţã de curba de calibrarã (pct. 5.6.1.2 sau 5.6.2.2).
Conţinutul w de vitamina E în mg/kg de probã este dat de urmãtoarea formulã:

w = 500 X â X V(2) [mg/kg]/V(1) x m,
în care:
â = concentraţia de vitamina E din soluţia de probã (pct. 5.4) în UI/ml;
V(1) = volumul soluţiei de probã (pct. 5.4), în æg/ml;
V(2) = volumul cantitãţii alicote folosite la pct. 5.4, în ml;
m = masa porţiunii de testat, în g.
7. Observaţii
7.1. Pentru probe cu concentraţie redusã de vitamina E poate fi util sã se combine extractele de eter de petrol din douã încãrcãturi de saponificare (cantitate cântãritã: 25 g) într-o soluţie de probã, pentru determinare HPLC.
7.2. Masa probei utilizate pentru analizã nu ar trebui sã conţinã mai mult de 2 g grãsime.
7.3. Dacã separarea fazicã nu are loc, se adaugã aproximativ 10 ml l etanol (pct. 3.1), pentru a întrerupe emulsia.
7.4. Dupã mãsurarea cu spectrofotometrul a soluţiei de tocoferol acetat sau DL-α-tocoferol, în conformitate cu pct. 5.6.1.3 sau 5.6.2.3, se adaugã aproximativ 10 mg BHT (pct. 3.12) la soluţie (3.10.1 sau 3.10.2) şi se pãstreazã soluţia la frigider (perioadã de pãstrare de maximum 4 sãptãmâni).
7.5. Poate fi folositã hidrochinona în loc de BHT.
7.6. Folosindu-se o coloanã fazicã normalã, este posibilã separarea unui a-, â-, Y şi tocoferol.
7.7. Se pot folosi aproximativ 150 mg acid ascorbic în loc de soluţie de ascorbat de sodiu.
7.8. Se pot folosi aproximativ 50 mg EDTA în loc de soluţie de sulfit de sodiu.
8. Repetabilitate
Diferenţa dintre rezultatele a douã determinãri paralele, efectuate pe aceeaşi probã, nu trebuie sã depãşeascã 15%, valoare relativã faţã de cel mai mare rezultat.
9. Rezultatele unui studiu de colaborare*)
------
*) = Realizat de grupul de lucru pentru furaje din Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs-und Forschungsanstalten (VDLUFA)


┌────────────┬────────────┬────────────┬────────────┬────────────┬───────────┐
│            │   Premix   │   Furaj    │ Concentrat │   Furaj    │  Purcel   │
│            │            │ cu premix  │  mineral   │  proteic   │           │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│ L          │    12      │   12       │      12    │      12    │     12    │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│ n          │    48      │   48       │      48    │      48    │     48    │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│medie       │   17380    │  1187      │     926    │      315   │    61,3   │
│[UI/kg]     │            │            │            │            │           │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│s(r)        │    384     │  45,3      │     25,2   │      13,0  │     2,3   │
│[UI/kg]     │            │            │            │            │           │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│r           │   1075     │ 126,8      │     70,6   │      36,4  │     6,4   │
│[UI/kg]     │            │            │            │            │           │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│CV(r)[%]    │   2,2      │  3,8       │      2,7   │      4,1   │     3,8   │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│s(R)        │   830      │  65,0      │     55,5   │     18,9   │     7,8   │
│[UI/kg]     │            │            │            │            │           │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│R [UI/kg]   │  2324      │  182,0     │    155,4   │     52,9   │    21,8   │
├────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼────────────┼───────────┤
│CV(R)       │  4,8       │  5,5       │      6,0   │      6,0   │    12,7   │
│[%]         │            │            │            │            │           │
└────────────┴────────────┴────────────┴────────────┴────────────┴───────────┘


    A x B x C x D x E x MW

F x G x H x 10000 x W

A = zona peak-ului pentru standardul intern, soluţie standard de calibrare ( pct. 3.17);
B = zona peak-ului triptofanului, extract (pct. 5.2) sau hidrolizat (pct. 3.3);
C = volumul, în ml (2 ml), al soluţiei de triptofan concentrat (pct. 3.15) adãugat soluţiei de calibrare (pct. 3.17);
D = concentraţia, în/æmol/ml (= 2,50), din soluţia de triptofan concentrat (pct. 3.15) adãugatã soluţiei de calibrare (pct. 3.17);
E = volumul, în ml, al soluţiei concentrate standard intern (pct. 3.16), adãugatã la extract (pct. 5.2) (= 5,00 ml) sau hidrolizat (pct. 5.3) (= 2,00 ml);
F = zona peak-ului pentru standardul intern, extract (pct. 5.2) sau hidrolizat (pct. 5.3);
G = zona peak-ului triptofanului, soluţie standard de calibrare (pct. 3.17);
H = volumul în ml (= 2,00) al soluţiei standard intern concentratã (pct. 3.16), adãugatã la soluţia standard de calibrare (pct. 3.17);
W = greutatea probei în g (corectatã la greutatea originalã, dacã este uscatã şi/sau degresatã);
MW = greutatea molecularã a triptofanului (= 204,23).
7. Repetabilitate
Diferenţa dintre rezultatele a douã determinãri paralele, efectuate pe aceeaşi probã, nu trebuie sã depãşeascã 10% valoare relativã faţã de cel mai mare rezultat.
8. Rezultate ale unui studiu de colaborare
A fost realizat un studiu de colaborare la nivelul comunitar (a patra intercomparaţie) în cadrul cãruia s-au analizat 3 probe, de cãtre 12 laboratoare, pentru a certifica metoda pentru hidrolizã. Au fost efectuate 5 replicate din fiecare probã. Rezultatele sunt oferite de tabelul urmãtor:


┌────────────────┬──────────────┬────────────────────┬────────────────┐
│                │   Proba 1    │      Proba 2       │    Proba 3     │
│                │    Furaj     │   Furaj pentru     │  Concentrat    │
│                │   pentru     │porcine suplimentat │   de furaj     │
│                │   porcine    │ cu L-triptofan     │ pentru porcine │
├────────────────┼──────────────┼────────────────────┼────────────────┤
│L               │     12       │      12            │      12        │
├────────────────┼──────────────┼────────────────────┼────────────────┤
│N               │     50       │      55            │      50        │
├────────────────┼──────────────┼────────────────────┼────────────────┤
│medie [g/kg]    │    2,42      │     3,40           │     4,22       │
├────────────────┼──────────────┼────────────────────┼────────────────┤
│S(r)[g/kg]      │    0,05      │     0,05           │     0,08       │
├────────────────┼──────────────┼────────────────────┼────────────────┤
│r[g/kg]         │    0,14      │     0,14           │     0,22       │
├────────────────┼──────────────┼────────────────────┼────────────────┤
│CV(r)[%]        │     1,9      │      1,6           │      1,9       │
├────────────────┼──────────────┼────────────────────┼────────────────┤
│s(R)[g/kg]      │    0,15      │     0,20           │     0,09       │
├────────────────┼──────────────┼────────────────────┼────────────────┤
│R[g/kg]         │    0,42      │     0,56           │     0,25       │
├────────────────┼──────────────┼────────────────────┼────────────────┤
│CV(R)[%]        │     6,3      │      6,0           │      2,2       │
└────────────────┴──────────────┴────────────────────┴────────────────┘

L: numãr de laboratoare
n: numãr de valori singulare
S(r): deviaţia standard a repetabilitãţii
S(R): deviaţia standard a reproductibilitãţii
r: repetabilitate
R: reproductibilitate
CV(r): coeficient de variaţie al repetabilitãţii
CV(R): coeficient de variaţie al reproductibilitãţii

A fost realizat un alt studiu de colaborare la nivelul comunitar (a treia intercomparaţie) în cadrul cãruia s-au analizat douã probe de cãtre 13 laboratoare, pentru a se certifica metoda de extracţie pentru triptofanul liber. Au fost efectuate analize replicate (5) din fiecare probã. Rezultatele sunt oferite de tabelul urmãtor:


┌────────────────┬──────────────────────┬─────────────────────┐
│                │        Proba 4       │       Proba 5       │
│                │   Amestec de grâu    │ Amestec de grâu şi  │
│                │       şi soia        │   soia (= proba 4)  │
│                │                      │ cu triptofan adãugat│
│                │                      │     (0,457 g/kg)    │
├────────────────┼──────────────────────┼─────────────────────┤
│L               │        12            │          12         │
├────────────────┼──────────────────────┼─────────────────────┤
│N               │        55            │          60         │
├────────────────┼──────────────────────┼─────────────────────┤
│medie [g/kg]    │       0,391          │        0,931        │
├────────────────┼──────────────────────┼─────────────────────┤
│S(r)[g/kg]      │       0,005          │        0,012        │
├────────────────┼──────────────────────┼─────────────────────┤
│r[g/kg]         │       0,014          │        0,034        │
├────────────────┼──────────────────────┼─────────────────────┤
│CV(r)[%]        │        1,34          │         1,34        │
├────────────────┼──────────────────────┼─────────────────────┤
│s(R)[g/kg]      │       0,018          │        0,048        │
├────────────────┼──────────────────────┼─────────────────────┤
│R[g/kg]         │       0,050          │        0,134        │
├────────────────┼──────────────────────┼─────────────────────┤
│CV(R)[%]        │        4,71          │         5,11        │
└────────────────┴──────────────────────┴─────────────────────┘

L: numãr de laboratoare
n: numãr de valori singulare
S(r): deviaţia standard a repetabilitãţii
S(R): deviaţia standard a reproductibilitãţii
r: repetabilitate
R: reproductibilitate
CV(r): coeficient de variaţie al repetabilitãţii
CV(R): coeficient de variaţie al reproductibilitãţii

A fost realizat un alt studiu de colaborare la nivel comunitar, în cadrul cãruia s-au analizat 4 probe de cãtre 7 laboratoare, cu scopul unei certificãri a triptofanului prin hidrolizã. Rezultatele sunt oferite mai jos. Analize replicate (5) au fost efectuate pe fiecare probã.


┌────────────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┐
│                │   Proba 1    │   Proba 2    │    Proba 3   │   Proba 4    │
│                │    Furaj     │ Hranã pentru │  Hranã din   │  Pudrã de    │
│                │  amestecat   │ peşte, cu    │ soia-fasole  │    lapte     │
│                │   pentru     │ nivel scãzut │  (CRM 119)   │   ecremat    │
│                │   porcine    │  de grãsime  │              │  (CRM 120)   │
│                │  (CRM 117)   │  (CRM 118)   │              │              │
├────────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│L               │      7       │       7      │       7      │       7      │
├────────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│N               │     25       │      30      │      30      │      30      │
├────────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│medie [g/kg]    │    2,064     │     8,801    │     6,882    │     5,236    │
├────────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│S(r)[g/kg]      │    0,021     │     0,101    │     0,089    │     0,040    │
├────────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│r[g/kg]         │    0,059     │     0,283    │     0,249    │     0,112    │
├────────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│CV(r)[%]        │     1,04     │      1,15    │      1,30    │     0,76     │
├────────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│s(R)[g/kg]      │    0,031     │     0,413    │     0,283    │     0,221    │
├────────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│R[g/kg]         │    0,087     │     1,156    │     0,792    │     0,619    │
├────────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│CV(R)[%]        │     1,48     │      4,69    │      4,11    │      4,22    │
└────────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┘

L: numãr de laboratoare
n: numãr de valori singulare
S(r): deviaţia standard a repetabilitãţii
S(R): deviaţia standard a reproductibilitãţii
r: repetabilitate
R: reproductibilitate
CV(r): coeficient de variaţie al repetabilitãţii
CV(R): coeficient de variaţie al reproductibilitãţii

9. Observaţii
9.1. Folosirea unor condiţii cromatografice speciale poate crea o mai bunã separare între tiptofan şi a-metil-triptofan.
Eluţie isocraticã urmatã de spãlarea gradientului de coloanã lichid cromatografie cu: 125 mm x 4 mm, C(18), ambalaje de 5 æm sau echivalent.
Temperatura coloanei: 32°C


    Faza mobilã:        A: 0,01 mol/KH(2)PO(4)/metanol, 95 + 5 (V + V) 1
                        B: Metanol
    Program gradient:   0 min. ....... 100% A      0% B
                        15 min. ....... 100% A     0% B
                        17 min. ....... 60% A     40% B
                        19 min. ....... 60% A     40% B
                        21 min. ....... 100% A     0% B
                        33 min. ....... 100% A     0% B

Debit: 1,2 ml/min.
Timpul total de separare: aproximativ 33 de minute
9.2. Cromatografia variazã în concordanţã cu tipul de HPLC şi de materialul de împachetare a coloanei folosit.
Sistemul ales trebuie sã fie capabil sã ofere o separare de bazã între tiptofan şi standardul intern. Mai mult, este important ca produsele de degradare sã fie bine separate de triptofan şi de standardul intern. Hidrolizatele fãrã standard intern trebuie testate pentru a se verifica linia de bazã pentru impuritãţi sub standardul intern. Este important ca timpul de achiziţie sã fie suficient de lung pentru eluţia tuturor produselor de degradare, altfel pot interfera limite cu eluţie târzie cu utilizãri cromatografice ulterioare. În domeniul funcţionãrii sistemul de cromatografie trebuie sã ofere rãspuns linear. Rãspunsul linear trebuie mãsurat cu o concentraţie constantã (normalã) a standardului intern şi a concentraţiilor variate de triptofan. Este important şi faptul cã mãrimea atât a peak-urilor triptofanului, cât şi a peak-urilor standardelor interne este cuprinsã în domeniul linear al sistemului HPLC/fluorescenţã. Dacã peak-ul triptofanului şi/sau al standardului intern este prea mic sau ridicat, analiza trebuie repetatã cu o altã cantitate de probã şi/sau cu un volum final schimbat.
9.3. Hidroxid de bariu
Cu timpul hidroxidul de bariu devine mai dificil de dizolvat.
Aceasta duce la o soluţie neclarã pentru determinarea HPLC ce poate produce rezultate scãzute pentru triptofan.

---------

Newsletter GRATUIT

Aboneaza-te si primesti zilnic Monitorul Oficial pe email

Tags: Monitorul Oficial, Acte Monitorul Oficial, Norme Metodologice, Autoritatea Nationala Sanitara Veterinara si Pentru Siguranta Animalelor, NORMA SANITARA VETERINARA din 1 februarie 2007

Comentarii

Fii primul care comenteaza.

MonitorulJuridic.ro este un proiect:

Atentie, Juristi!

5 modele Contracte Civile si Acte Comerciale - conforme cu Noul Cod civil si GDPR

Legea GDPR a modificat Contractele, Cererile sau Notificarile obligatorii

Va oferim Modele de Documente conform GDPR + Clauze speciale

Descarcati GRATUIT Raportul Special "5 modele Contracte Civile si Acte Comerciale - conforme cu Noul Cod civil si GDPR"