Comunica experienta
MonitorulJuridic.ro

Trimite prin Yahoo Messenger pagina: METODOLOGIE din 26 martie 2005 e evaluare a impactului substantelor periculoase din listele I si II si al substantelor prioritare/prioritar periculoase asupra mediului acvatic prin teste ecotoxicologice - alge verzi, dafnia, pesti

Cautare document

Termen: Tipul actului: Anul publicarii actului:

Cautare document

Termen: Tipul actului: Anul publicarii actului:

Copierea de continut din prezentul site este supusa regulilor precizate in Termeni si conditii! Click aici.
Prin utilizarea siteului sunteti de acord, in mod implicit cu Termenii si conditiile! Orice abatere de la acestea constituie incalcarea dreptului nostru de autor si va angajeaza raspunderea!

METODOLOGIE din 26 martie 2005 e evaluare a impactului substantelor periculoase din listele I si II si al substantelor prioritare/prioritar periculoase asupra mediului acvatic prin teste ecotoxicologice - alge verzi, dafnia, pesti

EMITENT: MINISTERUL MEDIULUI SI GOSPODARIRII APELOR
PUBLICAT: MONITORUL OFICIAL nr. 565 din 1 iulie 2005

Comenteaza legea

Metodologia de evaluare a impactului substanţelor prioritare/prioritar periculoase asupra mediului acvatic stabileşte efectul toxic al acestor substanţe asupra sistemelor biologice acvatice - alge verzi, dafnia, peştii - conţine:
A. Metodologia de determinare a toxicitãţii acute asupra algelor verzi;
B. Metodologia de determinare a toxicitãţii acute asupra Dafniilor;
C. Metodologia de determinare a toxicitãţii acute asupra peştilor;
D. Metodologia de determinare a toxicitãţii cronice asupra peştilor.
Speciile precizate pentru, testele de toxicitate sunt specii comune sistemelor ecologice acvatice din România, astfel: alge verzi de tipul Scenedesmus quadricuada, Chlorella vulgaris dafnii de tipul Daphnia magna peşti de tipul Cyprinus carpio.

A. Metodologia de determinare a toxicitãţii acute asupra algelor verzi.

A. 1. Testul de inhibiţie al algelor verzi

1. Caracteristici ale metodei
- determinã efectele substanţelor asupra creşterii algelor verzi;
- permite evaluarea efectelor substanţelor la câteva generaţii în 72 de ore;
- poate fi utilizatã pentru câteva tipuri de alge verzi unicelulare.
- uşor de aplicat pentru substanţele solubile în apã; la condiţiile test, acestea rãmân în apã.
- se foloseşte şi pentru substanţele care nu interfera direct cu mãsurarea creşterii algale.
- necesitã cunoaşterea proprietãţilor fizico-chimice ale substanţei de testat - solubilitatea în apã, evaporare, stabilitate chimicã, constantã de disociere, biodegradabilitate.
- la interpretarea rezultatelor ia în calcul diferite proprietãţi ale substanţei -formula, gradul de puritate, natura şi procentul impuritãţilor, prezenţa şi cantitãţile de aditivi, coeficientul de partiţie n-octanol/apã.

2. Definitii
Densitate celulara: numãrul de celule pe milimetru;
Creştere; creşterea densitãţii celulare peste perioada test;
Rata de creştere: creşterea densitãţii celulare pe unitatea de timp;
EC(50) - concentraţia substanţei care provoacã 50% reducere a creşterii celulare [E(b) C(50)] sau ratei de creştere [E(f) C(50)] fata de celulele martor.
NOEC - concentraţia cea mai mare la care nu se observã nici o inhibiţie semnificativã a creşterii algale faţã de martor.
Unitate de mãsurã: greutate pe volum (mg/l) sau greutate pe greutate (mg. Kg^-1.

3. Substanţa de referinţã
Substanţa de referinţã poate fi testatã ca un mijloc de demonstraţie cã în condiţiile de laborator sensibilitatea speciei test nu se modificã semnificativ.
Dicromatul de K poate fi folosit ca substanţã de referinţã.

4. Principiul metodei
O limitã test poate fi realizatã la 100 mg/l pentru a demonstra ca EC(50) este mai mare decât aceasta concentraţie.
Creşterea exponenţialã a culturilor de alge verzi selectate expuse la diferite concentraţii ale substanţei test se obţine în condiţii bine determinate
Soluţiile test sunt incubate pe o perioada de 72 h timp în care densitatea celulelor din fiecare soluţie este mãsuratã la 24 h. Inhibiţia creşterii algale este determinatã faţã de martor.

5. Criterii de calitate
Densitatea celularã din cultura de control ar trebui sã creascã cu un fector de minim 16 in 3 zile.
Concentraţiile substanţei test vor fi menţinute la 80% faţã de concentraţiile iniţiale tot timpul, corespunzãtor concentraţiei nominalizate.
Pentru substanţele care:
- sunt puţin solubile;
- capabile sã formeze emulsii sau dispersii;
- nestabile;
se vor face soluţii de fiecare datã.

6. Mod de lucru
Reactivi
Soluţii cu substanţele test. În funcţie de caracteristicile substanţei se vor face soluţii mamã.
Mediul test
Se foloseşte apã din reţea (trebuie cunoscutã duritatea, pH), apã distilatã sau apã deionizatã.
Aparatura
Echipament normal de laborator;
Sticle Winkler de 250 ml;
Camerã de numarare:
Temoluminostat;
Agitator magnetic;
Microscop.
Organisme test
Dintre speciile de alge verzi recomandã Selenastrum capricornutum L, Scenedesmus subspicatus, Scenedesmus quadricauda L.
Procedura test
Şirul concentraţiilor, în care apar efectele, este determinat pe baza rezultatelor obţinute de la mai multe serii experimentale. Douã mãsuratori ale creşterii (biomasa, rata creşterii) rezultã în urma mãsurãtorilor larg dispersate ale inhibiţiei creşterii; ambele trebuie sã fie utilizate în testul stabilirii de domeniu pentru ca progresia geometricã a concentraţiilor sã permitã estimarea atât a E(b) C(50) cât şi E(r)E(50).
Densitatea celularã iniţialã
Densitatea celularã iniţialã trebuie sã fie de aproximativ 10^4 cel/ml Selenastrum capricornutum sau Scenedesmus subspicatus sau Scenedesmus quadricauda. Când sunt folosite alte specii biomasa trebuie sã fie comparabilã.
Concentraţiile substanţei test
Pentru test se folosesc cel puţin 5 concentraţii în serie geometricã, la o rata a concentraţiei care sa nu depãşeascã 2,2. La concentraţiile cele mai mici trebuie sã ne se observe mici un efect asupra cresterii algale; cele mai mari concentraţii trebuie sã înhibe creşterea cu cel puţin 50% faţa de martor, în mod ideal trbuie sã opreascã complet creşterea.
Serii şi control
Testele trebuie sã includã 3 serii pentru fiecare concentraţie, trei sticle de control fara substanţã şi dacã este necesar cu substanţele aditive.
Performanţa testului
Culturile test conţin concentraţii dorite de substanţe şi inoculul cu alge verzi. Sticlele sunt agitate şi luminate continuu. Temperatura trebuie sã fie 21°-25° C +/- 2.
Densitatea celulara se mãsoarã la cel puţin 24 h, 48 h şi 72 h de la începerea testului.
pH -ul se mãsoarã la începutul şi sfârşitul testului. pH -ul de la testul de control nu trebuie sã devieze mai mult de 1,5 unitãţi în timpul testului.
Test limitã
Folosind procedurile descrise în aceastã metodã, o limitã test poate fi executatã la 100 mg/l pentru a demonstra cã EC(50) este mai mare decât aceastã concentraţie.
Dacã natura substanţei este de aşa fel încât o concentraţie de 100 mg/l în apã test nu poate fi atinsã, testul de limitã trebuie sã fie realizat la o concentraţie egalã cu solubilitatea substanţei (sau concentraţia maximã care formeazã o dispersie stabilã) în mediul utilizat.
Testul limitã trebuie sã fie realizat în cel puţin 3 serii experimentale cu acelaşi numãr de control.
Celelalte mãsurãtori ale creşterii - biomasa, rata creşterii - trebuie sã fie utilizate pentru testul limitã.
Dacã, într-un test limita se constatã o scãdere medie de 25% sau mai mult fie în biomasa fie în rata de creştere testul limitã şi testul de control, atunci trebuie fãcut un nou test.

7. Evaluare si raportare
Valorile densitãţii celulare din cultura test sunt trecute în tabel alãturi de concentraţii şi timpul când s-au facut mãsurãtorile. Valorile medii ale densitãţii celulare pentru fiecare concentraţie a substanţei test şi a martorului sunt reprezentate pe un sistem de coordinate în funcţie de timp; se obţine curba de creştere.
Pentru determinarea relaţiei concentraţie/efect trebuie utilizate 2 abordãri. Unele substanţe pot stimula creşterea la concentraţii mici, altele produc inhibiţii între 0 si 100%.

Spaţiul dintre curbele de creştere şi linia orizontalã N=No se calculeazã cu formula:


*Font9*
     N(1)-N(o)           N(1)+N(2)-2N(o)                  N(o-1)+N(o)+2N(o)
 A = ────────── X t(1) + ───────────────x(t(2)-t(1)+....+ ──────────────── x [t(o)-t(o-1)]
            2                     2                               2

Unde:
A = zona
N(o) = nr cel/ml la timpul t(o) (începutul testului)
N(1) = nr de celule mãsurate / ml la t(1)
N(n) = nr de celule mãsurate ml la t(n)
t(1) = timpul primei mãsurãtori dupã începutul testului
t(n) = timpul ultimei mãsurãtori dupã începutul testului
n - numãrul de mãsurãtori fãcute dupã începutul testului
Procentul inhibiţiei creşterii celulare pentru fiecare concentraţie a substanţei [I(A)] este calculat cu formula:


           A(c) - A(t)
    I(A) = ────────── x 100
               A(c)

Unde:
A(c)= zona dintre curba de creştere a martorului şi linia orizontalã N = N(o)
A(t) = zona dintre curba de creştere la concentraţia t şi linia orizontalã N
= N(o)
I(A) = valoarea probit care este valoarea estimatã de la linia de regresie
prin citirea concentraţiilor care este echivalentã cu 50% inhibiţie
I(A) = 50%). Denotã cã aceastã valoare pentru aceastã metodã de calcul este propusã ca sã aibã simbolul
E(b) C(50) Este esenţial ca
E(b) C(50) este fixatã cu perioada de expunere adecvata de exemplu E(b) C(50)(0-72 h)

A. 2 Determinarea toxicitãţii smbstantelor fata de algele verzi

1. Caracteristici ale metodei
- stabileşte influenţa toxicitãţii substanţelor prioritare/prioritar periculoase asupra procesului de fotosintezã al algelor verzi de tip Scenedesmus quadricauda L. şi Chlorella vulgaris L;
- exclude erorile la citire. Metoda a fost pusã la punct de cãtre ICIM şi apoi a fost standardizatã.
- testul se efectueazã în bouã etape:
1. testul preliminar - in care se stabileşte domeniul de concentraţii necesar a fi experimentat;
2. testul final - ale cãrui rezultai sunt înregistrate prelucrate şi interpretate.
- se stabileşte potenţialul toxic al unor substanţe individuale sau in amestec fata de reprezentanţi ai producãtorilor primari, alge verzi;
- rezultatele sunt folosite la stabilirea limitei maxime admisibile ale substanţelor în sistemele ecologice acvatice.

2. Principiul metodei
Se urmãreşte influenţa substanţelor asupra, intensitãţii procesului de fotosintezã al algelor verzi, evidenţiate prin reducerea producţiei de oxigen; producţia de oxigen este determinatã dupã 24 h, perioadã de timp în care probele an fost ţinute în condiţii constante de temperaturii şi iluminare.
Procentele de modificare a producţiei de oxigen permit evaluarea gradului de toxicitate a substanţei supusã testãrii, asupra organismului test.
Specii test: algele verzi - Scenedesmus qmadricauda L şi Chlorella vulgaris L provenite din cultura de laborator; acestea sunt specii comune sistemelor ecologice acvatice din ţara noastrã, rãspund bine la presiunea exercitatã de substanţã şi se înreţin relativ uşor în condiţii de laborator.

3. Reactivi, sticlãrie de laborator si materiale
Reactivii pentru determinarea oxigenului dizolvat în apã; metoda recomandatã este STAS 6536.
Reactivii de precipitare: clorura de mangan sau sulfat de mangan, hidroxid de sodiu sau hidroxid de potasiu şi ioduri de potasiu.
Reactivii de dizolvare şi titrate: acid sulfuric, tiosulfat de potasiu şi amidon.
Apa pentru diluţii: apã aeratã provenitã din reţeaua de alimentare cu grad mijlociu de duritate (7°G - 8°G) şi mineralizare redusã spre medie, de aproximativ 300 mg/l reziduu fix
Sticle pentru oxigen, tip Winkler, cu dop şlefuit şi etanş, cu capacitate de 200...300 ml, etalonate cu precizie pânã la 0,1 ml;
Pipete de 1 ml şi 2 ml cu diviziuni de câte 0,1 ml;
Biuretã de 50 ml si 100 ml;
Termoluminostat

4. Mod de lucru
Din cultura de alge se pregãteşte o suspensie de alge verzi, cu un conţinut de aproximativ 5000 celule/ml şi se repartizeazã câte 50 ml din acestea la 1000 ml soluţie de testat. Se monteazã în sticle pentru oxigen, serii duble de probe, astfel:
- prima serie de probe conţine apã de diluţie + suspensie de alge + substanţã toxicã în diverse concentraţii;
- a doua serie de probe conţine apã de diluţie + substanţã toxicã (în concentraţii identice cu prima serie;
- se monteazã şi 2 probe martor care conţin: apa de diluţie, iar cealaltã apã de diluţie + suspensie de alge
Se introduc toate probele în termoluminostat, menţinându-se timp de 24 h la temperatura constantã de 20°C şi iluminare permanentã de 4500 - 5000 lucsi.
Dupã perioada de incubaţie se determinã oxigenul dizolvat; metoda recomandatã este STAS 6536.

5. Evaluarea toxicitãţii substanţei investigate si raportare
Se foloseşte urmãtoarea formulã:


                       (OX + Ox) - (OB-Ob)
       Delta x = 100 x ───────────────────
                         (OB-Ob)

unde :
Delta x = modificarea producţiei de O(2) prin fotosintezã exprimatã în % la concentraţia datã;
OB = concentraţia O(2) din proba oarbã cu alge, dupã incubare;
Ob = concentraţia O(2) din proba oarbã, fãrã alge, dupã incubare
OX = concentraţia O(2) din proba conţinând substanţa toxicã sau amestecul de substanţe şi alge, dupã incubare;
Ox = concentraţia O(2) din proba conţinând substanţa toxicã sau amestecul de substanţe, fãrã alge, dupã incubare.
Valorile Delta x negative - indicã o acţiune toxicã a substanţei date iar valorile Delta x pozitive - indicã lipsa unei acţiuni toxice sau, în unele cazuri, ca substanţa respectivã are rol nutritiv şi compenseazã pânã la o anumita limita efectul toxic, conform figurii 1.

NOTA(CTCE)
----------
Fig. I. Caracteristicile producţiei de oxigen în cazul unei acţiuni toxice (curba III, IV), indiferente (curba I) şi stimulatoare (curba II) a unei substanţe - se gaseste in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I, nr. 565 din 1 iulie 2005, la pagina 21. (a se vedea imaginea asociata)

B. Metodologie de determinare a toxicitãţii acute asupra Dafniilor

Testul de toxicitate acutã pentru Daphnia

1. Caracteristici ale metodei
- din modulul trofodinamic reprezentat de grupul mare al consumatorilor, metodologia utilizeazã dafniile şi peştii;
- dafniile şi peştii sunt bune indicatoare ale efectelor substanţelor prioritare/prioritar periculoase pentru poluarea acvaticã;
- dafniile şi peştii sunt componente ale sectorului de ciclare al substanţelor prioritare/prioritar periculoase din sistemele ecologice acvatice.

2. Definitii
EC(50) - LC(50) pentru dafnia.
Toxicitatea acutã - concentratia medie efectivã [EC(50)] pentru imobilizare; acea concentraţie care imobilizeazã 50% din organismele test în timpul perioadei test.
Imobilizare - numãrul de arnimale care nu sunt capabile sã înoate 15 secunde dupã o uşoarã agitaţie în vasul test.
Unitãţi de mãsurã: greutate/volum (mg/l) sau ca greutate/greutate (mg kg^-1).
Substantã de referinţã - o substanţã de referinţã poate fi testatã ca o metodã de a demonstra cã în condiţii de laborator sensibilitatea organismelor test nu este modificatã semnificativ.

3. Principiul metodei
O limitã test poate fi realizatã la 100 mg/l pentru a demonstra cã EC(50) este mai mare decât aceastã concentraţie.
Dafniile sumt expuse timp de 48 h la substanţa adãugatã în diferite concentraţii în apã. Daca timpul este mai scurt, trebuie sã se precizeze în raport.
În condiţii identice de test şi concentraţii de substanţã adecvate, la diferite concentraţii se vor obţine diferite efecte asupra capacitãţii de înot a dafniei. La concentraţiile care produc 0 sau 100% imobilizare în timp de 48 h se calculeazã EC(50) dacã este posibil.
Se foloseşte testul static.

4. Criterii de calitate
Imobilizarea organismelor martor nu trebuie sã depãşeascã 10% la sfârşitul testului.
Organismele test nu trebuie sã fie la suprafaţa apei.
Se recomandã ca O(2) dizolvat din vasele test sã fie peste 3 mgl^-1 şi nu mai mic de 2 mgl^-1.
Concentraţiile substanţei test vor fi menţinute în vase la 80% din concentraţiile iniţiale pe toatã durata testului.
Pentru substanţele care:
- sunt puţin solubile;
- capabile sã formeze emulsii sau dispersii;
- nestabile.
se vor face soluţii de fiecare datã.
pH -ui nu trebuie sã varieze mai mult de 1 unitate.

5. Mod de lucru
Reactivi
Soluţiile substanţei test - se preparã în apa cunoscutã sau apa distilatã sau apa deionizatã; se preparã soluţia stoc, din care se fac concentraţii diferite.
Aparatura
Vase de sticlã;
Oxigenometru;
Aparat pentru mãsurarea temperaturii;
pH-metru;
Echipament pentru mãsurarea duritaţii apei.
Organisme test
Se recomanda utilizarea Daphnia magna Straus. Se poate folosi şi Daphnia pulex De Geer.
Organismele test trebuie sã fie mai tinere de 24 h, la începutul testului
Procedura test
Se face un test preliminar pentru a alege scara de concentraţii.
Expunerea dafniei se face astfel:
- durata: preferabil 48 h;
- numãr de animale: mai puţin de 20 animale, de preferat 10;
- încãrcare: cel puţin 2 ml de soluţie test
- concentraţia test; soluţia test trebuie preparata înainte de introducerea dafniilor, preferabil farã introducerea altui solvent decât apa; concentraţiile se fac geometric, la o ratã a concentraţiei ce nu depãşeşte 2,2. Concentraţiile care dau 0% şi 100% imobilizare dupã 48 h şi un domeniu de grade de imobilizare intermediare care sã permitã calcularea EC(50) la 48 h trebuie sã fie testate împreunã cu martorul.
Apa
Lumina - ciclul lumina - întuneric opţional;
Temperatura - temperatura test trebuie sã fie 18 - 22°C ± 1°C;
Aerate - nu este necesarã;
Hrãnire - pe durata testului nu se hrãnesc.
pH -ul şi O(2) se mãsoarã la începutul şi sfârşitul testului;
Compuşii volatili trebuie testaţi în vase închise, destul de largi pentru a preveni lipsa de O(2).
Dafniile sunt urmãrite cel puţin 24 h şi încã 48 h.
Test limitã
Folosind procedurile descrise în aceastã metodã, un test limitã poate fi realizat la 100 mg/l pentru a demonstra cã EC(50) este mai mare decât acea concentraţie.
Dacã natura substanţei este de aşa fel încât o concentraţie de 100 mg/l în apa test nu poate fi obţinutã, testul limitã trebuie sã fie executat la o concentraţie egalã cu solubilitatea substanţei sau concentraţia maximã care formeazã o dispersie stabilã în mediul utilizat.
Testul limitã trebuie sã foloseascã 20 dafnii, împãrţite în 2 sau 4 grupe, cu acelaşi numãr de martori; dacã apare imobilizarea trebuie repetat testul.

6. Evaluare si raportare
Pentru fiecare perioadã când se înregistreazã observaţiile, respectiv 24 şi 48 h procentajul de mortalitate este punctat în dreptul concentraţiei pe hârtie milimetricã.
Pentru fiecare observaţie de timp, EC(50) şi limitã de confidenţã (p = 0,05) trebuie sã fie estimate folosind procedurile standard; aceste valori trebuie rotunjite.
În acele cazuri când panta curbei concentraţiei rãspuns este prea abruptã sã permitã calcularea EC(50), o estimare graficã a acestei valori este suficientã.
Când la 2 concentraţii consecutive apropiate de rata 2,2, rata de imobilizare este numai de 0 şi 100%, aceste 2 valori sunt suficiente pentru a indica domeniul in care cade EC(50).
Dacã se observã cã stabilitatea sau omogenitatea substanţei test nu poate fi menţinutã, aceasta trebuie înregistratã şi luatã în considerare în momentul interpretãrii rezultatelor.
Raportul va cuprinde urmãtoarele informaţii:
- Informaţii despre organismele test - nume ştiinţific, tulpinã, sursã, hrãnire;
- Apa de diluţie şi caracteristicile importante - pH, temperaturã, duritate;
- Metoda de preparare a stocului şi soluţiilor test, pentru substanţele cu solubilitate micã în apã;
- Concentraţiile oricãror substanţe auxiliare;
- Lista concentraţiilor utilizate;
- Metode folosite şi rezultatele obţinute, dacã s-a efectuat analiza chimicã;
- Rezultatele testului limitã, dacã s-a fãcut;
- Descrierea echipamentului test;
- Regimul de iluminare;
- Dacã au fost îndeplinite criteriile de calitate;
- Un tabel care sã conţinã numãrul de dafnii imobilizate, concentraţia, timpul;
- Graficul care reprezintã curba relaţiei concentraţie/rãspuns la sfârşitul testului;
- Procedura statisticã de determinare a valorii EC(50);
- Substanţa de referinţã utilizatã;
- Cea mai mare concentraţie care nu a indus imobilizare în timpul perioadei test;
- Cea mai mica concentraţie test care a provocat 100% imobilizare în perioada test

C. Metodologia de determinare a toxicitãţii acute asupra peştilor

1. Caracteristici ale metodei
- determinã toxicitatea acutã letalã a substanţelor pentru peştii din apele de suprafaţã;
- necesitã cunoaşterea proprietãţilor fizico-chimice ale substanţelor investigate: solubilitatea în apã, presiunea vaporilor, stabilitatea chimicã, biodegradabilitatea, pentru selectarea celei mai adecvate metode test - staticã, semi-staticã sau curgere continuã - în scopul asigurãrii concentraţiilor constante de substanţã pe toatã durata testului;
- oferã informaţii referitoane la formula chimicã, gradul de puritate, natura şi procentele semnificative de impuritãţi, prezenţa şi cantitãţile aditivilor, coeficientul de partiţie n- octanol / apa, trebuie luate în considerare pentru organizarea testului şi interpretarea rezultatelor.

2. Definiţii
Toxicitate acutã - decelarea efectelor negative asupra organismelor într-un timp scurt (96 h) în prezenţa substanţei testate; se exprimã prin concentraţia medie letalã.
[CL(50)] - concentraţia substanţei din apa care omoarã 50 % din peştii test într-o perioadã de expunere continuã.
Unitãţi de mãsurã: exprimate in greutate / volum ( mg/l) sau greutate / greutate (mg/kg).

3. Principiul metodei
O limitã test poate fi efectuatã la 100 mg/l substanţã pentru a demonstra cã CL(50) este concentraţia mai mare decât aceastã concentraţie.
Peştii sunt expuşi la substanţa test dizolvatã în apã într-un şir convenabil de concentraţii pentru o perioadã de 96 h; mortalitãţile sunt înregistrate la intervale de cel puţin 24 h, iar concentraţiile ce omoarã 50 % din peşti [CL(50)] sunt necesare pentru fiecare observaţie.

4. Criterii de calitate
Mortalitãţile la lotul de control nu trebuie sã depãşeascã 10 % (sau un peşte dacã sunt folosiţi mai puţin de 10) ta sfârşitul testului.
Saturaţia O(2) dizolvat trebuie sã fie > 60 %.
Concentraţiile substanţelor test vor fi menţinute pânã la 80 % din concentraţia iniţialã pe toatã durata testului.
Pentru substanţele care se dizolvã uşor în mediu sau sunt stabile, concentraţia iniţialã este consideratã fiind echivalentul concentraţiei nominale.
Se vor preciza concentraţiile folosite pe toata durata testului şi ce condiţii experimentale au fost îndeplinite.
Pentru substanţe care:
- au solubilitate redusã în mediu test;
- sunt capabile sã formeze emulsii sau dispersii stabile;
- sunt nestabile în soluţii apoase,
concentraţia iniţialã va fi luatã ca concentraţie mãsuratã în soluţie la începutul testului. Concentraţia va fi determinatã dupã o perioadã de stabilizare, dar înainte de a introduce peştii.
În toate cazurile mãsurãtorile ce se fac, pe toatã durata testului, trebuie sã confirme cã, la concentraţia realã de expunere, pH -ul nu variazã cu mai mult de o unitate.

5. Mod de lucru
Metoda test poate fi de 3 tipuri:
* test static - Este testul de toxicitate în care soluţia test nu se schimbã (Soluţiile rãmân neschimbate pe toata durata testului);
* test semi-static - Este testul de toxicitate, în care soluţiile test sunt înoite în mod regulat (de ex. la 24 h);
* test cu curgere continuã - Testul de toxicitate în care apa este înoitã permanent în acvariile test.
Reactivi
Soluţiile substanţei test:
Soluţia stoc - se preparã prin dizolvarea substanţei în apa deionizatã;
Concentraţiile alese - se preparã din soluţia stoc prin diluare; dacã se lucreazã cu concentratii mari, substanţa poate fi dizolvatã direct in apa de diluţie.
Pentru obţinerea acestor concentraţii trebuie sã se cunoascã gradul de solubilitate. Substanţele trebuie sã fie testate pânã la limita de solubilitate. Pentru unele substanţe, precum substanţele cu solubilitate scãzutã sau cele care formeazã dispersie stabilã, se preparã o concentraţie deasupra limitei de solubilitate a substanţei pentru a se asigura cã se obţine acea concentraţie maxima solubilã / stabilã, farã ca aceastã, concentraţie sã perturbe altfel sistemul (ex. filmul de substanţã de la suprafaţa apei împiedicã oxigenarea apei). Dispersia ultrasonicã poate fi utilizatã, în cazul substanţelor cu solubilitate micã in apã, la prepararea soluţiilor stoc.
Când sunt folosite substanţe auxiliare, toate concentraţiile test trebuie sã conţinã aceeiaşi cantitate de substanţã auxiliarã. Martorii trebuie expuşi la aceeiaşi concentraţie de substanţe auxiliare asemãnãtoare celor utilizate în seriile test. Concentraţia substanţelor auxiliare trebuie sã fie minimã, fãrã a depãşi 100 mg /l în mediul test.
Testul trebuie realizat fãrã ajustarea pH -ului. Dacã existã o schimbare evidentã a pH-ului este necesar ca testul sã se repete cu un pH ajustat, iar rezultatele sã fie înregistrate. În acest caz valoarea pH-ului soluţiei stoc trebuie sã se ajusteze la valoarea pH-ului din apa de diluţie. Pentru acest scop se prefera HCl şi NaOH. Ajustarea pH-ului trebuie sa fie fãcutã astfel încât concentraţia substanţei test din soluţia stoc sã nu fie modificatã semnificativ. Trebuie, de asemenea, înregistratã orice reacţie chimicã sau precipitare fizicã a compusului test, datorate ajustãrii pH-ului.
Apa de diluţie
Se foloseşte apa potabilã, necontaminatã cu concentraţii cu potenţial de risc clor, metale grele sau alte substanţe, apa naturalã de bunã calitate sau apa reconstituitã. Apa trebuie sa aibã duritatea cuprinsã între 10 şi 250 mg /l [CaCO(3)] şi pH-ul cuprins între 6,0 şi 8,5.
Aparatura
- Toatã aparatura sã fie din material inert chimic.
- Sistem automatic de diluţie
- Dozator de O(2)
- Echipament pentru determinarea duritãţii apei
- Echipament adecvat pentru menţinerea temperaturii
- pH- metru
Peştii - test
Peştii trebuie sã fie sãnãtoşi, fãrã malformaţii, selecţionaţi dupã criterii de vârstã, posibilitate de întreţinere, sensibilitate relativã la substanţele chimice, comoditate pentru testare, factori economici, factori biologici, posibilitatea de comparare a datelor obţinute cu cele existente pe plan internaţional.
Pregãtirea materialului de experimentare
Trebuie ca peştii sã provinã dintr-un singur stoc, sã aibã aproximativ aceiaşi lungime şi vârstã, sã fie ţinuţi cel puţin 12 zile in condiţiile urmãtoare:
- de recirculare sau curgere continuã, potrivit sistemului;
- apa;
- lumina - 12 pânã la 16 ore iluminare zilnicã;
- concentraţia O(2) dizolvat: cel puţin 80 % saturaţie;
- hrãnire de 3 ori pe sãptãmânã, încetând hrãnirea lor cu 24 h înainte de începerea testului.
Mortalitate
În intervalul de 48 h de la introducerea în acvarii de acomodare se înregistreazã mortalitãţile şi se aplicã utmãtoarele criterii:
1. mortalitãţi mai mari de 10 % din populaţie în 7 zile conduce la eliminarea întregului lot;
2. mortalitãţi între 5 şi 10 % din populaţie conduce la continuarea perioadei de acomodare încã 7 zile; dacã nu se mai înregistreazã mortalitãţi, lotul este acceptat, altfel este eliminat întregul lot.
3. mortalitãţi mai mici de 5 % din populaţie conduce la acceptarea întregului lot.
Adaptare
Toţi peştii trebuie menţinuţi în apã de calitate şi temperaturã constantã timp de 7 zile, înainte de începerea testului.
Procedura test
Se fece un test preliminar cu scopul de a obţine informaţii despre şirul de concentraţii ce trebuie utilizat în testul principal.
În cazul în care sunt folosite substanţe auxiliare pentru mãrirea gradului de solubilitate a substanţelor greu solubile se monteazã o probã martor (test de control).
În funcţie de proprietãţile fizico - chimice ale substanţei test trebuie selectatã cea mai adecvatã dintre metodele enunţate mai sus. Peştii sunt expuşi la acţiunea substanţelor dupã cum urmeazã:
* durata - 96 h;
* numãr peşti: cel puţin 7 pentru fiecare concentraţie;
* acvarii de capacitate convenabilã în relaţie cu încãrcarea cu animale de experimentare;
* încãrcare: maxim 1 g /l pentru teste statice şi semi-statice, iar pentru cele cu curgere continuã încãrcarea poate fi mai mare;
* concentraţia test: cel puţin 5 concentraţii care diferenţiate printr-un factor de maxim 2,2 şi pe cât posibil extinse pe domeniul care sã acopere de la 0 la 100 % mortalitate;
* apa; vezi pct 7;
* lumina: 12 pânã la 16 h zilnic;
* temperatura: conform speciei, dar ± 1°C în orice test;
* concentraţia O(2) dizolvat: numai puţin de 60 % saturaţie O(2);
* hrãnire: nu,
Peştii sunt urmãriţi dupã primele 2 - 4 ore şi cel puţin la intervale de 24 ore. Peştii sunt consideraţi morţi, dacã la atingerea înotãtoarei codale nu apare nici o reacţie şi nu sunt vizibile mişcãrile respiratorii. Se noteazã peştii morţi şi sunt îndepãrtaţi din acvarii. Se noteazã şi anomaliile vizibile - pierderea echilibrului, înotul, funcţia respiratorie, pigmentaţia
Zilnic se mãsoarã pH, O(2) dizolvat, temperatura.
Test limita
Folosind procedurile descrise, o limitã test poate fi stabilitã la 100 mg/l pentru a demonstra cã CL(50) este mai mare decât aceastã concentraţie.
Dacã natura substanţei este astfel încât o concentraţie 100 mg /l în apa test nu poate fi atinsã, limita test trebuie stabilitã la o concentraţie egalã cu solubilitatea substanţei sau maxim de concentraţie ce formeazã o dispersie stabilitã în mediul folosit.
Pentru testul limitã se foloseşte acelaşi numãr de peşti - 7-10 peşti - ca şi pentru testul martor; teoria distribuţiei binomiale stabileşte ca în cazul când se folosesc 10 peşti cu zero mortalitate existã un grad de încredere de 99,9 % ca CL(50) este mai mare decât concentraţia folositã în testul limitã. Dacã se folosesc 7-8-9 peşti, absenţa mortalitãţii asigurã un grad de încredere de cel puţin 99 % însemnând cã CL(50) este mai mare decât concentraţia folositã.
Dacã se instaleazã letalitãţi, trebuie dezvoltat un studiu complex. Dacã sunt observate efecte subletale acestea trebuie notate.

6. Evaluare si raportare
Pentru fiecare perioadã pentru care s-au fãcut observaţii se reprezintã grafic procentul de mortalitate (24, 48, 72 si 96 h ) pentru fiecare perioadã de expunere faţã de concentraţie in scara logaritmicã.
Când este posibil şi pentru fiecare timp de observaţie, CL(50) şi limitele de confidenţã (p - 0,05) trebuie estimate prin folosirea procedurilor standard; aceste valori trebuie rotunjite la unitate sau la mai mult de 2 cifre semificative.
În acele cazuri în care panta curbei concentraţie / mortalitate este prea înclinatã pentru a permite calculul lui CL(50), o estimare graficã a acestei valori este suficientã.
Când 2 concentraţii consecutive într-un raport de 2,2 dau numai 0% şi 100 % mortalitate, aceste 2 valori sunt suficiente pentru a indica intervalul în care se situeazã CL(50).
Dacã s-a observat cã stabilitatea şi omogenitatea substanţei test nu poate fi menţinutã, aceasta trebuie notatã şi avutã în vedere la interpretarea rezultatelor.
Raportul trebuie sã includã urmãtoarele informaţii:
* informaţii privitoare la organismele test - nume ştiinţific, specie, gen, mãrime, numãrul folosit pentru fiecare concentraţie;
* sursa pentru apa de diluţie şi caracteristicile chimice principale - pH, duritate, temperatura;
* în cazul substanţelor cu solubilitate scãzutã în apa, se trece metoda de preparare a soluţiei stoc şi a soluţiilor test;
* concentraţia oricãrei substanţe auxiliare;
* lista de concentraţii folosite şi orice alte informaţii utilizabile privitoare la stabilitatea concentraţiilor substanţelor chimice testate în soluţia test;
* dacã se fac analize chimice sunt date metodele utilizate şi rezultatele obţinute;
* rezultatul testului limitã dacã s-a efectuat;
* motivaţia alegerii şi detaliile procedurii test utilizate (static, semi-static, cu curgere continuã, doza - rata, viteza curgerii, încãrcarea cu peşti, dacã apa este aeratã);
* descrierea echipamentului;
* regimul de iluminare;
* concentraţia O(2) dizolvat, valorile pH şi temperatura la fiecare 24 h;
* evidenţa cã criteriile de calitate au fost îndeplinite;
* un tabel ce indicã mortalitatea cumulativã la fiecare concentraţie şi la martor (şi martor pentru substanţa auxiliarã folositã, dacã se cere) la fiecare timp de observaţie recomandat;
* graficul curbei concentraţie / procentaj rãspuns la sfârşitul testului;
* valorile CL(50) la fiecare timp de observaţie recomandat (cu 95 % limitã de confidenţã);
* procedurile statistice utilizate pentru determinarea LC(50);
* dacã este folositã o recomandare privitoare la substanţã, trebuie menţionat rezultatul obţinut;
* concentraţia cea mai mare a testului, care nu provoacã mortalitate pe toatã durata testului;
* cea mai micã concentraţie ce provoacã 100% mortalitate pe perioada testului.

D. Metodologia de determinare a toxicitãţii cronice asupra peştilor - metoda de colorare hematoxitina eozinã

1. Principiul metodei
Pentru evidenţierea efectelor cronice ale substanţelor prioritare/prioritar periculoase s-a ales metoda de colorare hematoxilinã - eozinã, fiind o metodã accesibilã, permiţând decelarea efectelor structurale la nivelul mai multor organe vitale - branhie, intestin subţire, ficat, rinichi, musculaturã. Utilizarea acestei metode necesitã personal special calificat, deoarece nu este o metodã de rutinã.

2. Mod de lucru
Reactivi
alcool etilic absolut
formol
acetonã benzen hematoxilinã eozinã
albuminã
parafinã
Aparatura
Microtom;
termostat cu includere în parafinã
plita pentru întinderea secţiunilor
microscop
aparat de fotografiat
Sticlãrie
vase Borel
lame
lamele
Specia test - Cyprinus carpio L (crap),
Metodologia de intoxicare
Lotul de peşti supus experimentãrii a fost introdus în acvarii cu capacitatea de 30 l; în fiecare acvariu s-au introdus câte 20 de organisme.
Concentraţiile utilizate sunt subletale; alegerea concentraţiilor depinde de caracteristicile substanţei investigate.
Testele cronice se desfãşoarã în regim static.
Metoda de prelevare
Prelevarea peştilor intoxicaţi pentru investigaţiile histopatologice se face la intervale de 30 zile.
Procedura test
Recoltarea peştilor pentru analiza histopatologicã se face la 30, 60, 90, 120 şi respectiv 150 zile minim pânã la maxim un an.
Obţinerea preparatelor histologice - impune recoltarea fragmentelor de organe şi prelucrarea lor dupã o tehnicã de prelucrare histopatologicã.
Dupa disecţia peştelui se preleveazã fragmente de branhii, ficat, intestin subţire, rinichi, musculaturã, deoarece sunt organe vitale şi totodatã organe ţintã pentru orice substanţã care se acumuleazã sau are efect toxic.
Fixare
Fragmentele de organe obţinute în urma disecţiei sunt fixate în formol 10 %, pentru oprirea proceselor de degradare ce survin dupã moarte.
Deshidratare şi clarificare
Dupã fixare, piesele sunt deshidratate în baie de alcool etilic, de concentraţii crescãtoare (70°, 90°, 100°); dupã deshidratare fragmentele de organe sunt clarificate în acetonã şi benzen.
Piesele deshidratate şi clarificate sunt incluse în parafinã şi menţinute la temperaturã constantã de 57°C.
Blocurile de parafinã, ce conţin fragmentele de organe, sunt secţionate la microtom; grosimea secţiunilor este cuprinsã între 5 - 6 æ.
Colorare cu hematoxilinã eozinã
Secţiunile sunt întinse pe lame unse cu albuminã Mayer şi sunt ţinute la termostat cu includere în parafinã 5 - 24 h, la o temperaturã constantã de 37°C.
Pentru decelarea efectelor produse de substanţele investigate este necesarã colorarea secţiunilor şi obţinerea preparatelor fixe.
În acest sens, lamele cu secţiunile de organe sunt deparafinate în benzen. Apoi sunt trecute prin bãi succesive de alcool etilic de concentraţii descrescãtoare (100°, 90°, 70°), cu scopul de a elimina solventul parafinei, ultima baie fiind cu apã distilatã.
Secţiunile sunt colorate cu hematoxilinã şi eozinã. Aceşti coloranţi evidenţiazã componentele celulare, ca nucleul şi citoplasma.
Dupã colorare, secţiunile sunt deshidratate în alcool etilic de concentraţii crescãtoare (70°, 90°, 100°) şi, clarificate în benzen.
Preparatele microscopice sunt montate în balsam de Canada devenind preparate fixe.

3. Examinare şi raportare
Se realizeazã examinarea la microscopul optic şi se compara cu martorul.
Modificãrile celulare se descriu detaliat şi se fotografiazã.
-------------

Newsletter GRATUIT

Aboneaza-te si primesti zilnic Monitorul Oficial pe email

Tags: Monitorul Oficial, Acte Monitorul Oficial, Metodologie, Ministerul Mediului si Gospodaririi Apelor, METODOLOGIE din 26 martie 2005

Comentarii

Fii primul care comenteaza.

MonitorulJuridic.ro este un proiect:

Atentie, Juristi!

5 modele Contracte Civile si Acte Comerciale - conforme cu Noul Cod civil si GDPR

Legea GDPR a modificat Contractele, Cererile sau Notificarile obligatorii

Va oferim Modele de Documente conform GDPR + Clauze speciale

Descarcati GRATUIT Raportul Special "5 modele Contracte Civile si Acte Comerciale - conforme cu Noul Cod civil si GDPR"